一种针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗的构建制造技术

本发明专利技术涉及一种针对人肿瘤坏死因子α(TNF

【技术实现步骤摘要】
一种针对人TNF
α
分子的类风湿关节炎治疗性疫苗的构建


[0001]本专利技术属于生物和医药领域，具体地涉及一种针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)的类风湿关节炎治疗性质疫苗的构建方法和用途。

技术介绍

[0002]类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种严重的慢性全身性自身免疫性疾病，主要侵犯全身各处关节，呈多发性和对称性慢性增生性滑膜炎，由此引起关节软骨和关节囊的破坏，最后导致关节强直畸形，是继心血管疾病和癌症后的一种常见性慢性疾病。
[0003]该病在我国发病率高达0.36%，致残率15%，我国约有500万人患类风湿关节炎患者，还在呈上升趋势，并呈现年龄多层次、病种多样化趋势，因其发病率高、致残率高，对人类的健康危害极大，被喻为“不死的癌症”。RA作为一种自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明确，研究结果显示该病的发病机制与多种因素相关，包括遗传因素、环境因素及体内免疫状态等。研究发现RA的发生发展过程中机体免疫系统中的炎性细胞因子也发挥了重要的作用，如TNFα、IL
‑
1、IL
‑
15、IL
‑
6等。抑制炎性细胞因子的产生或阻断其作用，有望改善RA发生发展过程中的炎性反应，进而延缓RA的疾病进展。
[0004]在诸多RA相关的炎性细胞因子中，肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor alpha, TNFα)是最重要的炎性细胞因子之一。阻断TNFα作用已成为RA治疗领域的重要治疗手段。
[0005]目前已有三种TNFα拮抗剂成功上市，分别为Adalimumab（商品名Humira）、Infliximab（商品名Remicade）和Etanercept（商品名Enbrel），多项临床研究均已证实，这三种TNFα拮抗剂均可减轻RA关节的炎症反应，并可改善关节功能以及延缓病情的进展。这三种已上市的TNFα拮抗剂中，Adalimumab已经多年蝉联全球药物销售冠军，2019年销售额接近200亿美元，Infliximab与Etanercept也常年占据销售榜前20的位置。这些数据从另一个侧面反映了以TNFα为靶点的治疗策略具有巨大的市场及对RA具有良好的疗效。
[0006]然而，尽管TNFα拮抗剂治疗RA已取得了令人瞩目的成果，但昂贵的治疗费用和长期使用，对患者及其家庭造成了严重的经济负担，相当多的患者最终因不能支付高昂费用而停止治疗。针对目前RA的治疗现状，研发一种新型的、长效的并能拮抗TNFα炎性因子的RA治疗性疫苗可能是解决这一问题的有效方法。该RA治疗性疫苗能诱导机体不断产生相应抗体，中和RA发生、发展中分泌的炎性细胞因子，延缓RA患者的病情进展，进而改善其临床症状。针对TNFα靶点开发一种新型的疫苗研发思路已成为RA治疗领域的研究热点。NEOVACS公司研究开发的TNFα
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kinoid是一种以TNFα为靶点的RA治疗性疫苗。TNFα
‑
kinoid是重组人肿瘤坏死因子与血蓝蛋白载体(Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)结合形成的复合物。但在该公司开展的II期临床试验中，接受疫苗治疗的患者与对照组的临床疗效未出现显著性差异，患者未能诱导产生针对hTNFα的中和抗体。因此，如何提高疫苗的免疫原性，突破人体对TNFα的免疫耐受，是以TNFα为靶点的RA治疗性疫苗继续解决的问题。
[0007]因此，本领域迫切需要开发出一种具有高免疫原性，并且能够突破人体对TNFα的
免疫耐受的RA治疗性疫苗。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的就是提供一种具有高免疫原性，并且能够突破人体对TNFα的免疫耐受的类风湿关节炎(RA)治疗性疫苗，所述的针对人TNFα分子的类风湿关节炎治疗性疫苗具体为人TNFα抗原与载体蛋白重组CRM197通过化学偶联剂交联制得的hTNF
‑
CRM197结合疫苗。
[0009]本专利技术的另一目的就是提供一种生产针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)的治疗性疫苗的制备方法。
[0010] 在本专利技术的第一方面，提供了一种针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)
‑
载体蛋白偶联物，所述偶联物具有如式I所示的结构：(TNFα)n
‑
L
‑
C
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(式I)其中，TNFα是肿瘤坏死因子α；C是载体蛋白；L是连接TNFα和载体蛋白的接头，所述接头是4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo
‑
SMCC)与N
‑
琥珀酰亚胺S
‑
乙酰硫代丙酸盐(SATP)形成的共价键；n为偶联于所述载体蛋白的TNFα的平均偶联数量，且n为3
‑
10之间的整数或非整数；和
“‑”
为键。
[0011]在另一优选例中，n为5
‑
7之间的整数或非整数。
[0012]在另一优选例中，n为6
±
0.5的整数或非整数。
[0013]在另一优选例中，n为6
±
0.2的整数或非整数。
[0014]在另一优选例中，所述载体蛋白是白喉毒素。
[0015]在另一优选例中，所述载体蛋白是白喉毒素突变体CRM197。
[0016]在另一优选例中，所述载体蛋白（或CRM197）由大肠杆菌表达系统重组表达。
[0017]在另一优选例中，所述TNFα是人TNFα (hTNFα)。
[0018]在另一优选例中，所述TNFα是人TNFα (hTNFα)的全长序列。
[0019]在另一优选例中，所述的TNFα抗原由大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物表达系统，或昆虫杆状病毒表达系统重组表达。
[0020]在本专利技术的第二方面，提供了一种制备如本专利技术第一方面所述的偶联物的方法，包括步骤：(a) 用N
‑
琥珀酰亚胺S
‑
乙酰硫代丙酸盐(SATP)化学修饰TNFα抗原，再经脱酰基步骤添加羟胺酸脱去SATP上的酰基形成游离巯基；反应完成后，分离获得TNFα抗原中间体；(b) 用双功能偶联剂4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo
‑
SMCC)修饰载体蛋白，使得所述载体蛋白带有马来酰亚胺基团；反应完成后，添加氨基酸终止反应，并分离获得载体蛋白中间体；和(c) 将步骤(a)和步骤(b)中分别获得的TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合，
进行偶联反应，从而获得所述的偶联物；反应完成后，添加氨基酸终止反应；其中，所述TNFα抗原中间体与载体蛋白中间体混合的比例为摩尔比3:1至9:1，较佳地为5:1至7:1，更本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对人肿瘤坏死因子α (TNFα)
‑
载体蛋白偶联物，其特征在于，所述偶联物具有如式I所示的结构：(TNFα)n
‑
L
‑
C
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
（式I）其中，TNFα是肿瘤坏死因子α；C是载体蛋白；L是连接TNFα和载体蛋白的接头，所述接头是4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo
‑
SMCC)与N
‑
琥珀酰亚胺S
‑
乙酰硫代丙酸盐(SATP)形成的共价键；n为偶联于所述载体蛋白的TNFα的平均偶联数量，且n为3
‑
10之间的整数或非整数；和
“‑”
为键。2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述载体蛋白是白喉毒素突变体CRM197。3.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述TNFα是人TNFα的全长序列。4.一种制备如权利要求1所述的偶联物的方法，其特征在于，包括步骤：(a) 用N
‑
琥珀酰亚胺S
‑
乙酰硫代丙酸盐(SATP)化学修饰TNFα抗原，再经脱酰基步骤添加羟胺酸脱去SATP上的酰基形成游离巯基；反应完成后，分离获得TNFα抗原中间体；(b) 用双功能偶联剂4
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(N
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马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo
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SMCC)修饰载体蛋白，使得所述载...

【专利技术属性】
技术研发人员：范季瀛，陈国友，
申请(专利权)人：上海惠盾因泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：