控制分生组织大小以改良作物的方法技术

本发明专利技术涉及用于修饰植物中的FACIATED EAR2(FEA2)基因、任选地修饰分生组织尺寸的组合物和方法。本发明专利技术还涉及使用本发明专利技术的方法和组合物生产的具有增加的穗行数的植物。组合物生产的具有增加的穗行数的植物。组合物生产的具有增加的穗行数的植物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】控制分生组织大小以改良作物的方法
[0001]关于序列表电子提交的声明
[0002]根据37C.F.R.
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1.821，经由EFS
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Web提交了文件名为1499.26.WO_ST25.txt的ASCII文本格式的序列表，以代替其纸质副本。序列表大小为454,224字节，于2021年3月25日生成。该序列表在此通过引用将其公开内容并入说明书中。
[0003]优先权声明
[0004]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求2020年3月26日提交的美国临时申请No.63/000,206的权益，其全部内容通过引用并入本文。


[0005]本专利技术涉及用于修饰植物中的FACIATED EAR2(FEA2)基因、任选地用于修饰分生组织尺寸的组合物和方法。本专利技术还涉及使用本专利技术的方法和组合物生产的具有增加的穗行数(kernel row number)的植物。

技术介绍

[0006]新的植物器官在植物的称为分生组织的生长尖端处起始。在分生组织中维持着未分化干细胞群。在生长期间，分生组织将干细胞分配给新形成的器官，包括种子，同时保留一些干细胞以连续维持分生组织。已经描述了几种保守的分子机制，其控制干细胞群的大小以确保组织化生长和适当的分生组织大小。
[0007]由于玉米穗发育的模块化性质，较大的分生组织倾向于启动更多的花，因此，分生组织尺寸对穗行数和产量具有直接影响。在玉米穗的发育期间启动的花的数量直接限制了谷粒产量。围绕穗周围启动的增加数量的花(穗行数或KRN)是在玉米驯化期间选择的一个主要性状。通过育种的显著进步已经导致了穗行数的急剧增加，从作为玉米先辈的teosinte中的2行，到现代优秀玉米品种中的～8
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20行。在各种玉米品系中，穗行数可以高达36。
[0008]在模型植物拟南芥模型中描述的经典调控途径中，分生组织顶点中的细胞分泌CLAVATA3(CLV3)肽，其移动通过质外体进入中心干细胞结构域，在那里它与包括CLAVATA1(CLV1)和CLAVATA2(CLV2)的若干富含亮氨酸的受体(LRR)相互作用。这种受体
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配体相互作用刺激信号传导，其最终起到降低WUS表达和限制干细胞群扩增的作用。WUS的靶标之一是CLV3基因本身，通过这种方式，WUS起到限制其自身表达并维持干细胞稳态的作用(Fletcher,J.C.,Plants 7:87(2018))。
[0009]CLV1、CLV2或CLV3中功能丧失突变导致WUS结构域的扩增和增加的分生组织大小(Schoof等人,Cell 100:635
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644(2000))。通常，这种分生组织大小的增加导致异常的植物生长，因为分生组织不受控制地膨胀并且变得紊乱，这种现象被称为扁化(Je等人,Nat Genet 48:ng.3567(2016a))。重要的是，较大的分生组织不仅制造较大的器官，而且围绕较大区域的器官数量增加。由于分生组织大小和器官数目之间的这种关系，玉米CLV
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WUS信号传导基因中的突变可以导致增加的花数目和产量。然而，虽然玉米CLV2直系同源物
FACIATED EAR2(FEA2)中强的功能丧失突变导致扩大的分生组织和KRN的增加，但是穗是无序的，并且因此没有产量增加(Taguchi
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Shiobara等人,Gene Dev 15:2755
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2766(2001))。
[0010]需要用于调节分生组织大小的新策略以改善作物性能。

技术实现思路

[0011]本专利技术的一个方面提供了一种植物或其植物部分，其包含在编码FEA2蛋白的内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中的至少一个非天然突变。
[0012]本专利技术的第二方面提供了一种植物细胞，其包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)CRISPR
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Cas效应蛋白；和(b)引导核酸(gRNA、gDNA、crRNA、crDNA、sgRNA、sgDNA)，其包含与编码FEA2蛋白的内源性靶基因具有互补性的间隔子序列。
[0013]本专利技术的第三方面提供了在FEA2基因内包含至少一个非天然存在的突变的玉米植物细胞，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入或缺失，所述编辑系统包含与所述FEA2基因中的靶位点结合的核酸结合结构域。
[0014]本专利技术的第四方面提供了一种产生/培育无转基因的经过编辑的玉米植物的方法，包括：将本专利技术的玉米植物与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入所述无转基因的玉米植物中；和选择包含所述至少一个非天然突变且无转基因的子代玉米植物，从而产生无转基因的经过编辑的玉米植物。
[0015]本专利技术的第五方面提供了一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植物的方法，该方法包括在生长区域中种植本专利技术的两株或更多株植物，从而提供与不包含所述突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。
[0016]本专利技术的第六方面提供了一种在玉米FEA2蛋白的区域中产生变异的方法，包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码所述玉米FEA2蛋白的区域的玉米FEA2基因的区域，其中所述区域包含SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的氨基酸序列，或者所述区域由SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列编码；以及使所述玉米FEA2基因的区域与所述编辑系统接触，从而将突变引入玉米FEA2蛋白的区域中；以及在FEA2蛋白的区域中产生变异。
[0017]本专利技术的第七方面提供了一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中编辑特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割玉米植物细胞中的内源FEA2基因内的靶位点，所述内源FEA2基因包含与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，从而在玉米植物细胞的内源FEA2基因中产生编辑并产生在所述内源FEA2基因中包含所述编辑的玉米植物细胞。
[0018]第八方面提供了一种用于制造玉米植物的方法，其包括：(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞群与连接到核酸结合结构域(例如DNA结合结构域；例如编辑系统)的核酸酶接触，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列；或结合编码与SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的序列；(b)从所述群中选择其中至少一个野生型内源FEA2基因已经被突变的玉米植物细胞；和(c)将所选择的植物细胞生长成玉米植物。
[0019]第九方面提供了一种用于增加玉米植物中的穗行数的方法，包括：(a)使包含野生
型内源FEA2基因的玉米植物细胞与靶向所述野本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种植物或其植物部分，其在编码FEA2蛋白的内源FACIATED EAR2(FEA2)基因中包含至少一个非天然突变。2.根据权利要求1所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变。3.根据权利要求1或2所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是碱基取代、缺失和/或插入。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变包括向A、T、G或C的碱基取代。5.根据权利要求1
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3中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是至少一个碱基对的缺失，任选地约1个碱基对至约50个连续碱基对的缺失。6.根据权利要求1
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3中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变是至少一个碱基对的插入。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个非天然突变导致相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号而言位于位置475、476、477、478和/或479处的一个或多个被取代的氨基酸残基，任选地其中所述至少一个非天然突变是SEQ ID NO:74的位置477处的碱基取代。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的植物或其部分，其中所述FEA2蛋白包含与SEQ ID NO:74具有至少95％序列同一性的序列。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的植物或其部分，其中所述内源FACIATED EAR2(FEA2)基因包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73具有至少90％序列同一性的序列。10.根据前述权利要求中任一项上述的植物或其部分，其中所述植物是玉米。11.根据权利要求10所述的植物或其部分，其中包含所述至少一个非天然突变的所述玉米植物具有增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。12.一种包含编辑系统的植物细胞，所述编辑系统包括：(a)CRISPR
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Cas效应蛋白；和(b)引导核酸，其包含与编码FEA2蛋白的内源靶基因具有互补性的间隔子序列。13.根据权利要求12所述的植物细胞，其中所述内源靶基因包含与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。14.根据权利要求12或13所述的植物细胞，其中所述内源靶基因编码FEA2蛋白，所述FEA2蛋白包含与SEQ ID NO：74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。15.根据权利要求12
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14中任一项所述的植物细胞，其中所述引导核酸包含SEQ ID NO:79
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82的核苷酸序列中任一个所示的序列。16.根据权利要求12
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14中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞是玉米细胞。17.由权利要求1
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11中任一项所述的植物部分或权利要求12
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16中任一项所述的植物细胞再生的植物。18.根据权利要求17所述的植物，其中所述植物是玉米植物，并且包含增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。19.一种玉米植物细胞，其包含FEA2基因内的至少一个非天然突变，其中所述突变是使用编辑系统引入的取代、插入或缺失，所述编辑系统包含与FEA2基因中的靶位点结合的核
酸结合结构域。20.根据权利要求19所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变是显性负等位基因、半显性等位基因或弱的功能损失等位基因。21.根据权利要求20所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点在FEA2基因的区域内，所述区域包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列。22.根据权利要求20所述的玉米植物细胞，其中所述靶位点在FEA2基因的区域内，所述区域编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列。23.根据权利要求19
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22中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述编辑系统还包含核酸酶，所述核酸结合结构域结合与SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列内的靶位点，并且FEA2基因内的所述至少一个非天然突变在被所述核酸酶切割之后进行。24.根据权利要求23所述的玉米植物细胞，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如Fok1)或CRISPR
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Cas效应物蛋白。25.根据权利要求19
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24中任一项是的玉米植物细胞，其中所述核酸结合结构域是锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute或CRISPR
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Cas效应物核酸结合结构域。26.根据权利要求19
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25中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述FEA2基因内的所述至少一个非天然突变是插入和/或缺失。27.根据权利要求19
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25中任一项的玉米植物细胞，其中所述FEA2基因内的所述至少一个非天然突变包括点突变。28.根据权利要求19
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27中任一项所述的玉米植物细胞，其中所述至少一个非天然突变导致相对于SEQ ID NO：74的氨基酸位置编号而言位于位置475、476、477、478或479处的一个或多个被修饰的氨基酸残基，任选地，其中所述至少一个非天然突变包含SEQ ID NO：74的位置477处的修饰的氨基酸残基。29.由权利要求19
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28中任一项的植物细胞再生的玉米植物，其包含所述FEA2基因内的所述至少一个非天然突变。30.根据权利要求29所述的玉米植物，其中与不包含含有所述至少一个非天然突变的FEA2基因的对照植物相比，所述玉米植物包含增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。31.一种产生/培育无转基因的编辑过的玉米植物的方法，其包括：将权利要求1
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11、17、18、29或30中任一项所述的玉米植物与无转基因的玉米植物杂交，从而将所述至少一个非天然突变引入无转基因的所述玉米植物中；选择包含所述至少一个非天然突变并且无转基因的后代玉米植物，从而产生无转基因的编辑过的玉米植物。32.一种提供具有增加的穗行数的多个玉米植株的方法，所述方法包括在生长区域中种植权利要求1
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11、17、18、29或30中任一项所述的两个或更多个植物，从而提供与不包含所述至少一个非天然突变的多个对照玉米植物相比具有增加的穗行数的多个玉米植物。33.一种在玉米FEA2蛋白的区域中产生变异的方法，所述方法包括：将编辑系统引入玉米植物细胞中，其中所述编辑系统靶向编码玉米FEA2蛋白的所述区
域的玉米FEA2基因的区域中，其中所述玉米FEA2蛋白的所述区域包含SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76的氨基酸序列，或者所述玉米FEA2蛋白的所述区域由SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78的核苷酸序列编码；以及使玉米FEA2基因的区域与编辑系统接触，从而将突变引入玉米FEA2蛋白的区域并在FEA2蛋白的所述区域中产生变异。34.一种用于编辑玉米植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包括：以位点特异性方式切割所述玉米植物细胞中的内源FEA2基因内的靶位点，所述内源FEA2基因包含与SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列，或编码与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的序列，从而在所述玉米植物细胞的内源FEA2基因中产生编辑，以及产生包含在所述内源FEA2基因中的所述编辑的玉米植物细胞。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述靶位点包含与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的序列或编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的序列。36.根据权利要求34或35所述的方法，其中还包括从在所述内源FEA2基因中包含所述编辑的玉米植物细胞再生玉米植物，以产生在其内源FEA2基因中包含所述编辑的玉米植物。37.根据权利要求34
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36中任一项所述的方法，其中所述编辑导致非自然突变。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中在其内源FEA2基因中包含所述编辑的所述玉米植物具有增加的穗行数的表型，任选地其中穗长度没有实质性减少。39.根据权利要求32
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38中任一项所述的方法，其中所述内源FEA2基因编码FEA2蛋白，并且所述编辑导致相对于SEQ ID NO:74的氨基酸位置编号而言位于475、476、477、478或479位的氨基酸残基的变化。40.一种用于制造玉米植物的方法，其包括：(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞的群体与连接到核酸结合结构域的核酸酶接触(例如编辑系统)，其结合与SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：78的核苷酸序列或与编码与SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：76具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的序列具有至少90％序列同一性的序列；(b)从野生型内源FEA2基因已经突变的群体中选择玉米植物细胞。从而产生在内源FEA2基因中包含至少一个突变的玉米植物细胞；和(c)将所选的玉米植物细胞生长成玉米植物。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述至少一个突变是显性负突变、半显性突变或弱的功能损失突变。42.一种用于增加玉米植物中的穗行数的方法，其中包括：(a)使包含野生型内源FEA2基因的玉米植物细胞与靶向野生型内源FEA2基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶与结合所述野生型内源FEA2基因中的靶位点的核酸结合结构域(例如编辑系统)连接，其中所述野生型内源FEA2基因：(i)编...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：成对植物服务股份有限公司，
类型：发明
国别省市：