用于将绿原酸转化为异绿原酸的酶制造技术

本申请涉及能够将绿原酸转化为异绿原酸的蛋白质，所述蛋白质包含或组成为SEQ ID No.1、与该序列具有至少80％同一性的序列或该序列的片段的氨基酸序列。本申请还涉及用于由绿原酸制备异绿原酸的方法，该方法包括生成所述蛋白质并使其与绿原酸接触。述蛋白质并使其与绿原酸接触。述蛋白质并使其与绿原酸接触。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将绿原酸转化为异绿原酸的酶
专利

[0001]本专利技术的一个目的是提供其酶活性能够将绿原酸转化为异绿原酸的蛋白质。本专利技术的另一个目的是提供将绿原酸转化为异绿原酸的方法，包括生成根据本专利技术的蛋白质及其用于由绿原酸制备异绿原酸的用途。因此，本专利技术属于用于物质合成的重组酶的生成和用途的领域。
现有技术
[0002]异绿原酸或3，5
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二咖啡酰奎尼酸或3，5
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DCQ是目前众多研究的主题，并且其若干药理学性质表明了其重要的发展，特别是在疾病例如阿尔茨海默病和癌症、病毒性疾病的预防和/或治疗领域和化妆品应用中。3，5
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DCQ可以从植物中提纯，特别是从甘薯(Ipomoea batatas)中提纯(Harrison等人，“Contents of caffeoylquinic acid compounds in the storage roots of sixteen sweet potato genotypes and their potential biological activity”；J.Amer.Soc.Hort.Sci..133(4)：492
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500，2008)。然而，3，5
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DCQ的合成量相对较少，因此从植物中提纯既费力又昂贵，因此不适合广泛使用。此外，不同的咖啡酰奎尼酸异构体可以由相同的植物细胞制备，这还意味着与其他异构体相比，需要额外的分离3，5
‑
DCQ的步骤。
[0003]因此，需要以可靠、简单和廉价的方式获得大量异绿原酸的方法。
[0004]公布为WO 2013/178 705的国际申请描述了用于将绿原酸(CGA)转化为二、三或四咖啡酰奎尼酸的酶。所述酶的功能接近于HCT(羟基肉桂酰
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CoA莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶)或HQT(羟基肉桂酰
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CoA奎尼酸羟基肉桂酰转移酶)蛋白质的功能，更一般地属于BAHD酰基转移酶家族。
[0005]Kojima和Kondo(“An enzyme in sweet potato root which catalyses the conversion of chlorogenic acid，3
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caffeoylquinic acid，to isochlorogenic acid，3，5
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dicaffeoylquinic acid”，Agric.Biol.Chem.49(8)，2467
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9，1985)描述了存在于甘薯提取物中且能够将绿原酸转化为异绿原酸的酶，其功能未被精确鉴定且结构也未被公开。
[0006]Villegas等人(“Purification and characterization of chlorogenic potato roots”，Phytochemistry，vol.26(6)，1577
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81，1987)描述了能够将绿原酸转化为异绿原酸的绿原酸咖啡酰转移酶。)
[0007]Teutschbein等人(“Identification and localization of a lipase
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like acyltransferase in phenylpropanoid metabolism of tomato(Solanum lycopersicum”，J.Biol.Chem，285(49)，pp.38374
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81，2010)描述了对番茄提取物中绿原酸葡萄糖酸咖啡酰转移酶(CGT)的鉴定。
[0008]本专利技术人现已从甘薯提取物中分离并克隆了属于GDSL脂肪酶/酯酶家族的酶，其特征在于其氨基酸序列中存在下列四种氨基酸的连接：甘氨酸(G)
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天冬氨酸(D)
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丝氨酸(S)
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亮氨酸(L)。这种酶被称为：IbGDSL，意为“甘薯的GDSL酶”。本专利技术人还证明，这种酶能够将绿原酸转化为异绿原酸，具有高的底物特异性，并且仅或几乎仅产生3，5
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DCQ。
[0009]本专利技术满足上述要求，因为在用包含编码根据本专利技术的GDSL酯酶/脂肪酶的核苷酸序列的重组载体转化的宿主细胞转化后，并置于适宜的培养条件下，在所述宿主细胞的总蛋白提取物中检测到该酶。此外，本专利技术人已经证明，根据本专利技术的所述酶在以经分离的形式存在或在所述宿主细胞的培养基中存在时是功能性的。根据本专利技术的GDSL酯酶/脂肪酶专门催化3，5
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DCQ的形成，排除任意其他异构体。最后，本专利技术人已经证明，根据本专利技术的GDSL酯酶/脂肪酶有效地催化植物提取物中存在的绿原酸转化为3，5
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DCQ。
[0010]因此，本专利技术的第一个目的是提供能够将绿原酸转化为异绿原酸的蛋白质，其包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No.1、与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的序列、所述SEQ ID No.1的片段和与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的所述序列的片段。本专利技术的第二个目的是提供由绿原酸制备异绿原酸(3，5
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DCQ)的方法，该方法实施了根据本专利技术的蛋白质。本专利技术的第三个目的是提供根据本专利技术的蛋白质用于由绿原酸制备异绿原酸(3，5
‑
DCQ)的用途。

技术实现思路

[0011]根据第一个目的，本专利技术涉及包含或组成为选自以下的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID No.1、与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的序列、所述SEQ ID No.1的片段和与SEQ I D No.1具有至少80％同一性的所述序列的片段，所述蛋白质能够将绿原酸转化为异绿原酸。
[0012]根据该第一个目的的一个特定方面，本专利技术涉及重组蛋白，即由其遗传物质已被修饰的细胞产生的蛋白质。
[0013]“包含”意味着该要素存在，但也可能存在其他要素。在氨基酸序列的情况下，所述序列尤其还可以在所述序列的N端或C端侧包含其他氨基酸，这些其他氨基酸尤其可以促进感兴趣的蛋白质的表征和/或纯化。在核苷酸序列的情况下，所述序列尤其还可以在所述序列的3
′
或5
′
端包含其他核苷酸。
[0014]“组成为”是指除了提到的那些要素之外，不存在其他要素。然而，这一限制包括感兴趣的蛋白质可能的翻译后修饰。
[0015]“具有至少80％同一性”是指所述序列在最佳全局比对后具有至少80％的同一性，即两个序列之间的全局比对给出了它们之间最高的同一性百分比。两个序列的最佳全局比对尤其可以根据本领域技术人员熟知的Needleman
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Wunsch算法进行(Needleman和Wunsch，“A general method applicable to the search for similarities in the am本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种蛋白质，其包含或组成为选自以下的氨基酸序列：
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SEQ ID No.1，
‑
与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的序列，
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包含所述SEQ ID No.1的至少50个氨基酸的片段，和
‑
包含与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的所述序列的至少50个氨基酸的片段，所述蛋白质能够将绿原酸转化为异绿原酸。2.根据前述权利要求所述的蛋白质，其特征在于，其选自GDSL酯酶/脂肪酶，尤其是番薯属的GDSL酯酶/脂肪酶。3.根据前述权利要求所述的蛋白质，其特征在于，其选自甘薯的GDSL酯酶/脂肪酶。4.一种经分离的核酸分子，其编码根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质。5.根据权利要求4所述的经分离的核酸分子，所述分子包含或组成为选自以下的核酸序列：SEQ ID No.2和与SEQ ID No.2具有至少80％同一性的序列。6.一种重组载体，其包含至少一种根据权利要求4或5所述的核酸分子，将所述至少一种分子中的每一种都置于在宿主细胞中表达所述蛋白质所必需的工具的控制之下。7.一种宿主细胞，其包含至少一种根据权利要求4或5所述的经分离的核酸分子或至少一种根据权利要求6所述的载体。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，其选自酵母细胞，特别是毕赤酵母菌株的酵母细胞，或者选自植物细胞，特别是本氏烟草。9.一种制备异绿原酸的方法，其包括在适宜的反应条件下，使绿原酸与蛋白质接触，以获得富含异绿原酸的组合物，所述蛋白质包含或组成为选自以下的氨基酸序列：
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SEQ ID No.1，
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与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的序列，
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包含所述SEQ ID No.1的至少50个氨基酸的片段，和
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包含与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的所述序列的至少50个氨基酸的片段，所述蛋白质能够将绿原酸转化为异绿原酸。10.根据权利要求9所述的方法，其还包括：
‑
在合适的培养基中和适宜的条件下培养能够表达蛋白质的宿主细胞的在先步骤，所述蛋白质包含或组成为选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No.1、与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的序列、包含所述SEQ ID No.1的至少50个氨基酸的片段和包含与SEQ ID No.1具有至少80％同一性的所述序列的至少50个氨基酸的片段，任选地将产生的所述蛋白质纯化，和/或所述绿原酸以经分离的形式存...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗雷德里克，
申请(专利权)人：法国里尔大学塞尔恩戈公司，
类型：发明
国别省市：