新的重组细胞表面标志物制造技术

本公开涉及包含短近膜序列的EGFR衍生多肽、编码其的核酸以及使用其来改进截短的EGFR标志物的细胞表面表达的方法。标志物的细胞表面表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的重组细胞表面标志物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年3月20日提交的美国临时申请62/992,806和于2021年1月13日提交的美国临时申请63/137,022的优先权。上述临时申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表。序列表在此通过引用以其整体并入。该ASCII副本创建于2021年3月19日，命名为026225_WO012_SL.txt，大小为60,198字节。
[0005]专利技术背景
[0006]受体酪氨酸激酶(ErbB)的表皮生长因子家族由四个成员组成：EGFR/ErbB1/HER1、ErbB2/HER2/Neu、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4(Wieduwilt和Moasser,Cell Mol Life Sci.(2008)65(10):1566
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84)。这些受体在上皮、间充质和神经元组织中广泛表达，并在细胞增殖、分化和发育中起关键作用(Yano等人,Anticancer Res.(2003)23(5A):3639
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50)。它们被诱导表皮生长因子受体(EGFR)同源物的同源或异源二聚化的配体激活。EGFR是180kDa的单体糖蛋白，其包含大的胞外区、单跨越性跨膜结构域、胞内近膜区、酪氨酸激酶结构域和C端调节区。胞外区包含四个结构域：结构域I和III是同源配体结合结构域，结构域II和IV是富含半胱氨酸的结构域(Ferguson,Annu Rev Biophys.(2008)37:353
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3)。
[0007]人EGFR的结构化结构域III被FDA许可的单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab，)靶向。通过受体的选择性截短，将EGFR的西妥昔单抗结合能力与其生物活性分离提供了潜在的惰性的完全人细胞表面标志物(Li等人,Cancer Cell(2005)7(4):301
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11；Wang等人,Blood(2011)118(5):1255
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63)。然而，临床上有用的细胞表面标志物的关键特征在于该标志物需要在工程化细胞中以持续高水平表达，以便工程化细胞可在需要时被充分识别和靶向。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供了重组多肽，其包含胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区包含人表皮生长因子受体(EGFR)结构域III序列，并且胞内区(i)包含在前至少三个氨基酸中为净中性或净正电荷的近膜结构域(ii)但缺乏活性EGFR酪氨酸激酶结构域。在一些实施方案中，多肽不具有任何活性酪氨酸激酶结构域。
[0009]在一些实施方案中，近膜结构域超过一半的氨基酸是甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和/或脯氨酸。在一些实施方案中，近膜结构域每个位置处的氨基酸根据表1进行选择。例如，近膜结构域包含RRRHIVRKR(SEQ ID NO:16)、RRRHIVRK(SEQ ID NO:17)、RRRHIVR(SEQ ID NO:18)、RRRHIV(SEQ ID NO:19)、RRRHI(SEQ ID NO:20)、RRRH(SEQ ID NO:21)、RRR、RKR、或RR。在某些实施方案中，胞内区不包含任何被磷酸化的残基。
[0010]在一些实施方案中，人EGFR结构域III序列可包含SEQ ID NO:2或其功能性变体，例如包含与SEQ ID NO:2至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，胞外区在结构域III
序列的C端还包含：(i)源自EGFR结构域IV的序列，(ii)人工序列，或(iii)(i)和(ii)二者。在特定实施方案中，胞外区包含SEQ ID NO:1的氨基酸334
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504、334
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525或334
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645。
[0011]在一些实施方案中，跨膜区源自人EGFR跨膜结构域，任选地包含SEQ ID NO:5。
[0012]在一些实施方案中，重组多肽包含源自人EGFR、人粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)、人Igκ、小鼠Igκ或人CD33的信号肽。例如，信号肽可包含SEQ ID NO:22、23、24或25。
[0013]在特定实施方案中，重组多肽包含SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；或与其至少90％相同的氨基酸序列。
[0014]另一方面，本公开提供了核酸分子，例如表达构建体，其包含本公开的重组多肽的编码序列。在一些实施方案中，核酸分子还包含嵌合抗原受体(CAR)的编码序列。CAR可靶向例如肿瘤抗原，如AFP、BCMA、CD19、CD20、CD22、CD123、EpCAM、GPC2、GPC3、HER2、MUC16、ROR1、或ROR2。在进一步的实施方案中，CAR可以是双特异性的，靶向例如CD19和CD20或CD19和CD22。在某些实施方案中，重组多肽和CAR的编码序列可操作地连接到同一启动子(如，组成型或诱导型启动子；例如，MND启动子)，使得这两个编码序列共转录，并且任选地，这两个编码序列由(i)内部核糖体进入位点(IRES)或(ii)自切割肽(如，2A肽)的编码序列分隔开，其中重组多肽、CAR和自切割肽的编码序列彼此在阅读框内。
[0015]在一些实施方案中，核酸分子还包含第三多肽的编码序列，任选地其中第三多肽是人c
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Jun或其功能类似物。在进一步的实施方案中，重组多肽、CAR和人c
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Jun的编码序列可操作地连接到同一启动子(如，组成型或诱导型启动子；例如，MND启动子)，使得这三个编码序列共转录，并且任选地，这三个编码序列由(i)IRES或(ii)自切割肽(如，2A肽)的编码序列彼此分隔开，其中重组多肽、CAR、人c
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Jun和自切割肽的编码序列彼此在阅读框内。
[0016]在一些实施方案中，核酸分子是病毒载体，任选地是慢病毒或逆转录病毒载体。
[0017]在其他方面，本公开提供了包含本文所述核酸分子的细胞(如，自体或同种异体人T细胞)；包含所述核酸分子的重组病毒体；以及包含所述细胞、核酸分子或病毒体和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0018]在另一方面，本公开提供了治疗有需要的患者的方法，包括向患者施用细胞，任选地其中细胞是自体的或同种异体的。在一些实施方案中，患者患有癌症，并被给予本文所述的T细胞制剂，其中所述T细胞表达对癌症中存在的肿瘤抗原特异的CAR、T细胞受体(TCR)、工程化TCR或TCR模拟物。在进一步的实施方案中，该方法包括一旦已经治疗患者(如，癌症已经消退)，就向患者施用有效量的对人EGFR特异性的抗体，其中所述抗体对表达重组多肽的T细胞引发细胞毒性，并且任选地所述抗体是IgG
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组多肽，其包含胞外区、跨膜区和胞内区，其中所述胞外区包含人表皮生长因子受体(EGFR)结构域III序列，并且所述胞内区(i)包含在前面的至少三个氨基酸中为净中性或带净正电荷的近膜结构域，(ii)但缺少活性EGFR酪氨酸激酶结构域。2.如权利要求1所述的重组多肽，其中所述近膜结构域多于一半的氨基酸是甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和/或脯氨酸。3.如权利要求1或2所述的重组多肽，其中所述近膜结构域的每个位置处的氨基酸根据表1选择。4.如权利要求1所述的重组多肽，其中所述近膜结构域包含RRRHIVRKR(SEQ ID NO:16)、RRRHIVRK(SEQ ID NO:17)、RRRHIVR(SEQ ID NO:18)、RRRHIV(SEQ ID NO:19)、RRRHI(SEQ ID NO:20)、RRRH(SEQ ID NO:21)、RRR、RKR、或RR。5.如前述权利要求中任一项所述的重组多肽，其中所述胞内区不包含任何被磷酸化的残基。6.如前述权利要求中任一项所述的重组多肽，其中所述结构域III序列包含SEQ ID NO:2。7.如前述权利要求中任一项所述的重组多肽，其中所述胞外区在结构域III序列的C端还包含：(i)源自EGFR结构域IV的序列，(ii)人工序列，或(iii)(i)和(ii)二者。8.如权利要求7所述的重组多肽，其中所述胞外区包含SEQ ID NO:1的氨基酸334
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504、334
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525、或334
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645。9.如前述权利要求中任一项所述的重组多肽，其中所述跨膜区源自人EGFR跨膜结构域，任选地包含SEQ ID NO:5。10.如前述权利要求中任一项所述的重组多肽，其还包含源自以下的信号肽：人EGFR、人粒细胞
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巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)、人Igκ、小鼠Igκ、或人CD33。11.如权利要求1所述的重组多肽，所述重组多肽包含SEQ ID NO:26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40；或与其至少90％相同的氨基酸序列。12.一种核酸分子，其包含前述权利要求中任一项所述的重组多肽的编码序列。13.如权利要求12所述的核酸分子，其还包含嵌合抗原受体(CAR)的编码序列。14.如权利要求13所述的核酸分子，其中所述重组多肽和所述CAR的编码序列可操作地连接到同一启动子，使得所述两种编码序列共转录，并且任选地，所述两种编码序列由(i)内部核糖体进入位点(IRES)或(ii)自切割肽的编码序列分隔开，其中所述重组多肽、所述CAR和...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：莱尔免疫制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：