用于纳米电子测量的工程改造大分子制造技术

本发明专利技术提供了对酶进行工程改造以使其整合到分子纳米线中作为生物聚合物测序/识别的功能组件的方法。所述酶包括但不限于天然的、突变的或合成的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA连接酶、DNA外切核酸酶、逆转录酶、RNA引物酶、核糖体、蔗糖酶或乳糖酶。蔗糖酶或乳糖酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于纳米电子测量的工程改造大分子
交叉参考
[0001]本申请要求2020年1月31日提交的美国临时专利申请号62/968,929的权益，其通过引用全文纳入本文。


[0002]本公开涉及被设计用于集成到用于生物聚合物传感/识别或测序的电子电路中的工程改造生物分子。

技术介绍

[0003]生物系统中常见的聚合大分子通常包含一组定义的构件，这些构件以特定的顺序连接，即所谓的序列。所述序列定义了聚合物的三维结构及其在生物系统中的功能。在蛋白质的情况下，该功能可以是酶促反应或结合事件；在碳水化合物的情况下，该功能可以是识别元件。在核酸的情况下，该功能可以是遗传信息的载体。因此，准确确定聚合物大分子的序列对于理解其功能至关重要。
[0004]在核酸的特定情况下，第一代脱氧核糖核酸(DNA)测序技术(“Sanger测序”)采用了一种分析在本体溶液中进行的酶促反应聚合产物的方法[1]。该技术在理想条件下的读取长度可以达到1000个碱基对(bp)或更多。这种方法被用于国际人类基因组计划，耗时10多年，耗资约27亿美元来生成第一个人类基因组序列[2,3]。尽管这项技术适用于对小的遗传元件(如环状质粒)进行测序，但作为大规模基因组学的工具是不可行的。下一代测序(NGS)技术是针对$1000基因组开发的，并且已经降低了对人类基因组进行测序的成本和时间[4,5]。然而，由于NGS的读取长度短，NGS受到人类基因组中复杂的结构变异和重复序列的阻碍。
[0005]此外，由于NGS不如Sanger测序准确，因此更经常需要深度测序，尤其是在确定突变时。使用标记酶而不是标记核苷酸的NGS变异仍然只能产生短读数[6]。
[0006]为此，开发了第三代测序技术，在单分子水平上对核酸进行解码。例如，Pacific Biosciences测序平台使用零模式波导(zero
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mode waveguides,ZMW)，它检测单个掺入事件发出的荧光信号[7]。该技术可以读取较长的DNA序列，但存在错误率相对较高的问题。因此，在包括个性化医疗和流行病学在内的广泛应用中，需要一个具有更高准确性、更直接分析和更低部署成本的测序平台。
[0007]其他方法使用纳米孔进行测序。生物纳米孔，如由Oxford Nanopore Technologies销售的那些，使用跨膜蛋白孔[8]。虽然这项技术提供了更长的读取长度，但它也存在准确性低的问题，因此经常与NGS结合使用。生物纳米孔芯片的制造成本很高，阻碍了可负担的测序和广泛的部署。
[0008]由半导体技术产生的无机材料中的固态纳米孔可以以具有成本效益的方式大规模生产[9]。然而，固态纳米孔的几何形状不能像生物孔那样精确地控制。因此，必须将传感机制纳入固态纳米孔进行测序，而不是测量离子电流。
[0009]已经描述了纳米孔和生物传感器的各种排列。一种方法[10]是使用生物传感器将来自三磷酸核苷酸类似物的杂交探针送入纳米孔，以引发可检测的响应。另一种在[11]中被普遍性地描述的方法是将纳米间隙的两侧与一个桥分子连接起来，该分子传递由核苷酸掺入事件引起的相关生物传感器的构象变化。这些组件的理想配置可最大限度地提高灵敏度和重现性。
[0010]系统的各个组件也可能在组成上不同。例如，桥可以包括碳纳米管或DNA纳米线，但后者具有化学定义和可在离散位置进行官能化的独特优势。然而，单个DNA分子的电导率存在争议，尤其是当其长度超过30nm时。来自大肠杆菌和噬菌体phi29的DNA聚合酶(phi29pol)通常用作生物传感器。诸如[11]、[12]、[13]和[14]中的公开内容广泛涵盖了探针、生物传感器和连接器的无数配置，而没有详细说明如何实现它们。例如，[13]中的一个建议实施方式描述了使用成熟的硫醇
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马来酰亚胺耦合化学将生物传感器选择性偶联到探针上，并进一步承认这样做可能需要去除生物传感器中的所有其他半胱氨酸残基，而这不是一项简单的任务。在phi29pol的特定情况下，七个天然半胱氨酸残基必须突变为其他天然存在的残基。这样做提出了一个真正的挑战，需要大量的实验，因为酶只是勉强稳定，即使是单点突变也会导致有害的功能后果[15,16]。在其他情况下，半胱氨酸残基对于酶的结构或功能是必不可少的。例如，木瓜蛋白酶在其催化循环中使用半胱氨酸残基[17]。作为另一个例子，抗体通常使用由半胱氨酸残基形成的二硫键来维持其结构[18]。公开[13]还描述了采用以遗传学方式掺入的非天然氨基酸以促进偶联的实施方式，引用“点击化学”作为非限制性示例。已经描述了几种不同类型的生物相容性偶联化学；然而，要确定哪个(哪些)最适合将生物传感器连接到探针需要大量的实验。在[12]中发现了另一个有问题的公开示例，其中生物传感器使用多个连接点附着，以通过将生物传感器与探针紧密耦合来提高灵敏度。然而，蛋白质表面提供了许多潜在的偶联位点，需要大量的实验来确定与探针的最佳接触点。如果没有预定的附着点，就无法控制酶探针的方向，这可能对探针功能产生显著影响。此外，增加附着位点的数量组合地增加了配置的可能性。蛋白质融合标签已在现有技术中广泛用于增强蛋白质表达、溶解度和活性[19]。在聚合酶的特定情况下，融合来自硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的蛋白质Sso7d已被证明可以通过保持与DNA的结合来增强热稳定性聚合酶的持续合成能力[20]。在另一个例子中，谷胱甘肽
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S
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转移酶(GST)已与phi29pol融合以帮助纯化，但这样做需要添加海藻糖以保持蛋白质溶解度[21]。不使用此类添加剂而增强表达和溶解度的聚合酶的实施方式是合乎需要的。附图简述
[0011]图1说明了工程改造蛋白质作为分子装置中的传感组件的原理。
[0012]图2显示了通过点击锚与蛋白质偶联的双重DNA(DNA duo)。
[0013]图3显示了掺入蛋白质中用于偶联和固定的硒代半胱氨酸及其衍生物的结构。
[0014]图4显示了苯丙氨酸衍生的非天然氨基酸掺入蛋白质中以进行偶联和固定化。
[0015]图5显示了赖氨酸衍生的非天然氨基酸掺入蛋白质中以进行偶联和固定化。
[0016]图6以示意图形式显示了本专利技术中工程改造DNA的构型。
[0017]图7显示了带有溶解度域的DNA聚合酶，其中一些天然残基被非天然氨基酸取代(显示为空间填充模型)。
[0018]图8显示了phi29DNA聚合酶的七个天然半胱氨酸残基(显示为空间填充模型)。
[0019]图9说明了包含修饰核苷酸的DNA线的结构。
[0020]图10显示了用于内部修饰DNA的功能分子。
[0021]图11显示了化合物1007和1008的合成路线。
[0022]图12显示了phi29聚合酶的两个半胱氨酸突变体的凝胶分析图像。A)SUMO
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phi29突变体C11A和C11V从Ni
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于生物聚合物的识别、表征、或测序的系统，包括a.由相邻放置的第一电极和第二电极形成的纳米间隙；b.长度与纳米间隙相当的核酸分子线，其通过分别通过化学键将分子线的一端附着到第一电极并且将分子线的另一端附着到第二电极来桥接纳米间隙，其中分子线内预定位置处的两个内部核苷被官能化，允许蛋白质或传感分子的附着，并且其中分子线在每一端具有一个或多个附着位点；和c.具有两个附着位点的传感探针，其附着到分子线上的两个相应官能化位点，可以与生物聚合物相互作用或进行化学或生化反应，其中两个附着位点与分子线上的两个官能化位点相互作用并控制传感探针的方向。2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，其还包括：a.施加在第一电极和第二电极之间的偏置电压；b.记录由传感探针和生物聚合物之间的相互作用引起的通过分子线的电流波动的装置；和c.用于识别或表征生物聚合物或生物聚合物亚基的数据分析软件。3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，其中所述生物聚合物选自DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、多肽、寡核苷酸、多糖和它们的类似物，或者是天然的、合成的、修饰的，以及它们的组合。4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述传感探针选自核酸探针、酶、受体、配体、抗原和抗体，可以是天然的、突变的、合成的、以及它们的组合。5.如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述酶选自天然的、突变的、合成的DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA连接酶、DNA外切核酸酶、逆转录酶、RNA引物酶、核糖体、蔗糖酶、乳糖酶，以及它们的组合。6.如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述酶经工程改造以在预定位点包含非天然氨基酸。7.如权利要求6所述的系统，其特征在于，用于蛋白质工程改造的非天然氨基酸是硒代半胱氨酸或苯丙氨酸或赖氨酸或其衍生物，可以是天然的、合成的、突变的或它们的组合。8.如权利要求5所述的系统，其特征在于，DNA或RNA聚合酶上的两个工程改造位点被配置为一个位点在指状结构域中，而另一个位点在外切核酸酶、手掌、拇指、TPR1或DTPR2结构域中。9.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述DNA或RNA聚合酶被工程改造为仅包含一个或两个半胱氨酸残基以用于附着到所述分子线。10.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述DNA或RNA聚合酶被工程改造为包含至少一个硒代半胱氨酸，或者其中至少一个半胱氨酸被硒代半胱氨酸替代。11.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述分子线选自单核酸双链体、双重核酸双链体、核酸三链体、核酸四链体、核酸折纸结构及其组合；其中核酸链是A
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型、B
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型或Z
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型，并且核酸碱基是天然的或非天然的。12.如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述单核酸双链体包含在每条链上的预定位置处的官能化核酸碱基和在每条双链体末端或每条链末端处的一个附着位点；双重核酸双链体在每个双链体上具有一个官能化的核酸碱基，在每个双链体的末端具有一个附着位
点。13.如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述核酸双链体的序列是回文的。14.如权利要求1所述的系统，其特征在于，核酸分子线在其内部碱基之一的预定位置包含氨基官能团。15.如权利要求14所述的系统，其特征在于，具有氨基官能团的碱基进一步用带有活化羧酸盐的部分官能化，包括但不限于叠氮化物、马来酰亚胺、环外烯烃马来酰亚胺、呋喃、二苯并环辛烷、四嗪、三嗪、噁二唑砜。16.如权利要求11所述的系统，其特征在于，所述双重核酸双链体包括两个双链PNA、XNA或DNA/RNA、DNA/PNA、DNA/XNA、RNA/PNA、RNA/XNA或PNA/XNA的杂合体，可以是天然的、修饰的、合成的或它们的组合，或被两条双链PNA、XNA或DNA/RNA、DNA/PNA、DNA/XNA、RNA/PNA、RNA/XNA或PNA/XNA的杂合体取代，可以是天然的、修饰的、合成的或它们的组合。17.如权利要求1所述的系统，其特征在于，核酸分子线包含至少50％的GC碱基对。18.如权利要求1所述的系统，其特征在于，纳米间隙尺寸或两个电极末端之间的距离为约2至1000nm，或约5至100nm，或约5至30nm。19.如权利要求1所述的系统，其特征在于，纳米间隙包括多个纳米间隙，每个纳米间隙包括一对电极、分子线、传感探针和与单个纳米间隙相关的任何特征。20.用于生物聚合物的识别、表征、或测序的方法，包括a.通过放置彼此相邻的第一电极和第二电极来...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：通用测序技术公司，
类型：发明
国别省市：