一种完整视网膜铺片制作方法技术

本发明专利技术公开了一种完整视网膜铺片制作方法，可以极大地提高视网膜铺片的制作效率，同时减少了视网膜铺片制作过程中组织的破坏方便定位视网膜各组织(如黄斑等)以及减少制作过程中出现的卷曲，折叠等现象，便利各种后续实验技术的开展。实验技术的开展。实验技术的开展。

【技术实现步骤摘要】
一种完整视网膜铺片制作方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种视网膜铺片的制作方法。

技术介绍

[0002]视网膜铺片可应用于多种科学研究，包括视神经节细胞的定量染色，视网膜定位注射，以及各种视网膜组织的电生理研究和免疫组化研究，是眼科体内研究中不可或缺的一环。传统的视网膜铺片方法为：小鼠眼球取出后，沿角膜缘后0.5mm剪开,去掉角膜和晶状体,剥离出视网膜组织，此时的视网膜自然卷曲呈纺锤状，将卷曲的视网膜放置在载玻片上,沿四个方向剪开视网膜并逐渐展平。
[0003]传统视网膜铺片制作方法存在诸多不足：视网膜做四叶草切瓣后，翻转至神经纤维层朝上的步骤可能会导致四瓣扇形视网膜组织不同程度的卷边或堆叠；视网膜切开后，破坏了视网膜组织上的血管，使得定位视网膜各部位的难度较大，研究者需要付出大量时间和精力去分辨视网膜铺片中组织的位置，这将极大地降低了后续观察研究的效率；视网膜切开后，在组织病理学和分子生物学实验中将不利开展。比如载玻片上滴抗体混合液及清洗液时常因液面张力等因素四瓣视网膜发生卷曲或者翻转，免疫染色实验常常因此而失败。
[0004]因此，为保证后续研究的顺利开展，本领域需要一种能够保持视网膜完整的高效率视网膜铺片制作方法。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种完整视网膜铺片的制作方法，可以极大地提高视网膜铺片的制作效率，同时减少了视网膜铺片制作过程中组织的破坏方便定位视网膜各组织(如黄斑等)以及减少制作过程中出现的卷曲，折叠等现象，便利各种后续实验技术的开展。
[0006]具体地，本专利技术提供了一种完整视网膜铺片制作方法，包括如下步骤：(1)解剖眼球，将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中；(2)将载玻片直接沿远离视网膜组织的培养皿边缘放入，调整位置；(3)吸除培养基；(4)展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态一段时间。
[0007]在某些实施方式中，所述步骤(1)中培养基量液面要深于载玻片厚度。
[0008]在某些实施方式中，所述培养基含有胰岛素，孕酮溶液(progesterone)，亚硒酸钠(sodium selenite)，甲状腺素T3，毛喉素(Forskolin)，乙酰半胱氨酸，BDNF，CNTF，FGF，GNTF等，成分也可根据实验需求进行调整。
[0009]在某些实施方式中，所述步骤(2)中将载玻片直接移动至视网膜组织正下方.
[0010]在某些实施方式中，所述步骤(3)中吸除培养基采用多次少量的方式。进一步地，每次吸除后用虹膜恢复器缓慢调整视网膜组织的位置和展开卷边的视网膜边缘，保证每下调一次液面，视网膜组织卷起的周边都被展平。
[0011]在某些实施方式中，所述步骤(4)中维持该状态的时间30s以上。进一步地，维持该状态的时间可以为2min左右。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0013]1)视网膜铺片的制作效率更高：传统视网膜铺片为了防止视网膜瓣组织卷曲，需要将视网膜铺片视神经纤维层向下贴合培养皿底部，在做剪开操作后为了观察RGC通常需要将视网膜铺片翻转为视神经纤维层向上再做处理，在这个过程中，经常会发生视网膜铺片的向上卷曲和堆叠。而本专利技术制作视网膜铺片采用“少量多次”的方式吸除培养基，每次吸除后逐步调整视网膜组织的位置和视网膜边缘的方式，免去了剪开和翻转等工序。同时，由于本专利技术制作的视网膜铺片操作者更易于把控而操作速度更快，因此本专利技术制作的视网膜铺片将极大地提高制作效率。
[0014]2)更易定位：传统视网膜铺片在切割后，四瓣状的视网膜组织破坏了视网膜原有的血管组织，使得定位黄斑等部位变得困难，而本专利技术在解剖眼球后不采取切开视网膜组织的方式，而是采用利用培养基液体张力逐步达到展平视网膜的效果，保留了完整的视网膜结构，根据血管走行，极大地降低了定位黄斑等部位的时间和难度，缩短了视网膜铺片后续研究的时间。
[0015]3)更利于其他实验的开展：在组织病理学和分子生物学实验中，传统的视网膜铺片由于4片视网膜组织瓣的结构，各种液体试剂更易使其发生卷曲和变形，对上述实验的开展造成一定的影响。而本专利技术的铺片中完整的视网膜结构，在定型后，较难发生卷曲和变形，这为后续实验的顺利开展奠定了基础。
附图说明
[0016]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
[0017]图1传统视网膜铺片和本专利技术视网膜铺片的示意图。
[0018]图2本专利技术铺片制作流程
[0019]图3本专利技术视网膜铺片示意图(X10，共聚焦显微镜)
[0020]图4传统视网膜铺片(X4)
[0021]图5小鼠视神经钳夹伤后7天视网膜铺片单位面积内的RGC数。
具体实施方式
[0022]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例的附图，对本专利技术实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本专利技术所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
[0024]改良小鼠全视网膜铺片制作方法
[0025]本专利技术提供的改良小鼠全视网膜铺片制作方法主要分为4个步骤：
[0026](1)解剖眼球后将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中，培养基量
液面要深于载玻片厚度(图2A)。
[0027](2)随后将载玻片直接沿远离视网膜组织的培养皿边缘放入，调整位置，将载玻片直接移动至视网膜组织正下方(图2B)。
[0028](3)多次少量的吸除培养基，每次吸除液体后用虹膜恢复器调整视网膜组织的位置和展开卷边的视网膜边缘；这一步一定要缓慢并且保证每下调一次液面，视网膜组织卷起的周边都被展平(图2C)。
[0029](4)吸出培养皿内所有培养基，展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态2min(图2D)。
[0030]实验鼠为C57BL/6小鼠。实验鼠的年龄可为任意年龄段。
[0031]步骤(1)中，培养基含有胰岛素，孕酮溶液(progesterone)，亚硒酸钠(sodium selenite)，甲状腺素T3，毛喉素(Forskolin)，乙酰半胱氨酸，BDNF，CNTF，FGF，GNTF等，成分也可根据实验需求进行调整。在用培养基浸泡视网膜组织之后，应当用镊子轻轻调整位置，将切开分离好的视网膜组织视神经纤维层朝上放置。
[0032]步骤(2)中，在放置载玻片时，培养皿一定要深度超过载玻片的厚度，目的是调整载玻片位置的同时不破坏视网膜组织。同时放置载玻片需从远离视网膜组织的一段缓慢放入，避免视网膜组织翻转。每张视网膜的取材一般为小鼠角膜缘后1mm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种完整视网膜铺片制作方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)解剖眼球，将视网膜组织调整至神经纤维层朝上浸泡在培养基中；(2)将载玻片直接沿远离视网膜组织的培养皿边缘放入，调整位置；(3)吸除培养基；(4)展平的视网膜植片贴在载玻片上，维持该状态一段时间。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基量液面要深于载玻片厚度。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将载玻片直接移动至视网膜组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏卿，吴甦潜，莫晓芬，
申请(专利权)人：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，
类型：发明
国别省市：