表达天冬氨酸脱氢酶的工程菌及发酵生产维生素B5的方法技术

本发明专利技术涉及微生物领域，具体涉及表达天冬氨酸脱氢酶基因aspDH的大肠杆菌，及其用于发酵生产维生素B5(VB5)的方法。通过比较VB5的发酵产量，过表达aspDH基因的效果最好。与高污染的化学法生产维生素B5相比，本发明专利技术生物法生产维生素B5，具有原料可再生，废渣、废水和废气易于处理和资源化利用等优点，从而在实践上可用于维生素B5的工业化生产，具有重要的应用价值。值。

【技术实现步骤摘要】
表达天冬氨酸脱氢酶的工程菌及发酵生产维生素B5的方法


[0001]本专利技术涉及微生物领域，特别涉及表达天冬氨酸脱氢酶的工程菌及发酵生产维生素B5的方法。

技术介绍

[0002]维生素B5(Vitamin B5，VB5)又称D
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泛酸(D
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Pantothenic acid)，是一种水溶性维生素，是辅酶A及酰基载体蛋白的组成部分，作为70多种酶的辅助因子参与糖、脂肪、蛋白质和能量代谢，具有重要的生理代谢调控作用。VB5主要用于动物饲料添加剂、食品添加剂和医药原料药，随着VB5新功能的发现和应用领域的拓展，其市场需求仍将呈现稳定增长的趋势。
[0003]中国是VB5生产和出口的第一大国，工业生产VB5方法为化学合成法，企业基本采用异丁醛
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甲醛
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氢氰酸法合成DL
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泛解酸内酯，DL
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泛解酸内酯进一步通过化学或酶法拆分获得L
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泛解酸内酯，最后L
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泛解酸内酯与以丙烯腈为原料生产的β
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丙氨酸合成VB5。化学合成VB5的主要原料易燃、易爆、剧毒，生产过程中会产生含氰废水，处理难度大，导致VB5成为重污染产业。
[0004]近几年环保对VB5产业的影响已经逐步显现。在大规模高强度的环保治理下，高污染的VB5企业限产甚至停产，市场供应短缺，价格暴涨，限制了下游饲料、食品和医药行业的健康发展。在高污染的VB5生产技术没有重大改进之前，这样的供需局面仍会长期持续，因此，VB5绿色制造技术的创新迫在眉睫！
[0005]微生物发酵法生产VB5，不仅以可再生的葡萄糖为原料，而且生产过程中形成的废渣、废水和废气易于处理和资源化利用，可有效解决VB5产业的高污染问题。微生物利用葡萄糖合成VB5的代谢途径的调控机制复杂，发酵产量极低。β
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丙氨酸作为C3底物与D
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泛解酸合成VB5。为了提高VB5的发酵产量，需要在发酵培养基中外源补加大量的β
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丙氨酸(Sahm，H.，et al.，(1999)ApplEnviron Microb，65，1973
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1979；Dusch，N.，et al.，(1999)Appl Environ Microb，65， 1530
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1539；Zhang，B.，et al.，(2019)Food Chemistry，294，267
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275.)。β
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丙氨酸可以通过L
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天冬氨酸脱羧产生，因此，增强天冬氨酸的生物合成有望提高发酵法生产VB5的产量。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术通过在发酵法生产VB5的大肠杆菌中分别过表达上述三个酶，发现AspDH比AspC和AspA更有利于提高VB5的发酵产量。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供了增强天冬氨酸脱氢酶基因aspDH的表达在生产维生素B5中的应用；
[0009]作为优选，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH来源于戴尔福特菌Csl
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4 (Delftia sp.Csl
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4)。
[0010]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH具有：
[0011](I)、如SEQ ID No.55所示的核苷酸序列；或
[0012](II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0013](III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
[0014]在本专利技术的一些具体实施方案中，还包括：
[0015](1)、在cadA基因中插入强启动子和/或强RBS，其中强启动子为PgapA，强RBS为BCD2；
[0016]作为优选，所述BCD2具有：
[0017](A)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
[0018](B)、如(A)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(A)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0019](C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
[0020]和/或
[0021](2)、表达了来源于大肠杆菌BL21的ilvGM基因；和/或
[0022](3)、表达了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的L
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天冬氨酸α
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脱羧酶基因panD；和/或
[0023]作为优选，所述来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的L
‑ꢀ
天冬氨酸α
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脱羧酶基因panD具有：
[0024](a)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或
[0025](b)、如(a)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(a)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0026](c)、与(a)或(b)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；和/或
[0027](4)、增加了panB、panC和/或panE基因的拷贝数。
[0028]第二方面，本专利技术还提供了表达载体，包含天冬氨酸脱氢酶基因aspDH；作为优选，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH来源于戴尔福特菌Csl
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4(Delftia sp. Csl
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4)；
[0029]作为优选，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH具有：
[0030](I)、如SEQ ID No.56所示的核苷酸序列；或
[0031](II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或 (III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
[0032]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体还包括：
[0033](i)、强启动子和/或强RBS；
[0034]其中强启动子为PgapA，强RBS为BCD2；
[0035]作为优选，所述BCD2具有：
[0036](A)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
[0037](B)、如(A)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(A)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
[0038](C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
[0039]和/或
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.增强天冬氨酸脱氢酶基因aspDH的表达在生产维生素B5中的应用；作为优选，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH来源于戴尔福特菌Csl
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4(Delftia sp.Csl
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4)。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH具有：(I)、如SEQ ID No.56所示的核苷酸序列；或(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，还包括：(1)、在cadA基因中插入强启动子和/或强RBS，其中强启动子为PgapA，强RBS为BCD2；作为优选，所述BCD2具有：(A)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或(B)、如(A)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(A)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；和/或(2)、表达了来源于大肠杆菌BL21的ilvGM基因；和/或(3)、表达了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的L
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天冬氨酸α
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脱羧酶基因panD；和/或作为优选，所述来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的L
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天冬氨酸α
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脱羧酶基因panD具有：(a)、如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或(b)、如(a)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(a)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(c)、与(a)或(b)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；和/或(4)、增加了panB、panC和/或panE基因的拷贝数。4.表达载体，其特征在于，包含天冬氨酸脱氢酶基因aspDH；作为优选，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH来源于戴尔福特菌Csl
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4(Delftia sp.Csl
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4)；作为优选，所述天冬氨酸脱氢酶基因aspDH具有：(I)、如SEQ ID No.56所示的核苷酸序列；或(II)、如(I)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(III)、与(I)或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，还包括：(i)、强启动子和/或强RBS；其中强启动子为PgapA，强RBS为BCD2；作为优选，所述BCD2具有：(A)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(B)、如(A)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(A)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或(C)、与(A)或(B)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；和/或(ii)、来源于大肠杆菌BL21的ilvGM基因；和/或(ii...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘树文，温廷益，孙佳慧，李忠财，张芸，邓爱华，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：