NK细胞的滋养细胞、其制备方法和应用技术

NK细胞的滋养细胞、其制备方法和应用。本发明专利技术公开了一种NK细胞的滋养细胞，所述滋养细胞表达NK细胞活化相关配体，所述NK细胞活化相关配体包括膜结合型CD48。利用本发明专利技术进行外周血NK细胞培养、外周血或脐带血单个核体系中NK细胞的定向扩增，可实现NK细胞的大量扩增与分化成熟。传代培养后14天，外周血NK可实现百倍扩增，脐带血NK可扩增至初始数量的千倍。制备所得的NK细胞活化性受体表达高，未出现抑制性受体的表达增加，具备对于白血病或淋巴瘤细胞系的杀伤功能。本发明专利技术制备方法简单有效，生产成本较低，可批量生产，并实现NK细胞批量扩增，临床应用前景广阔。临床应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】
NK细胞的滋养细胞、其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞
，特别涉及NK细胞的滋养细胞、其制备方法和 应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤(NK)细胞为机体一类重要的固有免疫细胞，表型以CD56
+
CD3
‑
为主，具有较强的杀伤功能与免疫调节功能。NK细胞对于异常细胞的识别不受 主要组织相容性受体的限制，可在细胞因子或人工抗原提呈细胞作用下，分泌 穿孔素、颗粒酶，或分泌肿瘤坏死因子α(TNF
‑
α)、干扰素γ(IFN
‑
γ)等，达 到直接杀伤异常细胞的目的；且NK细胞可通过膜表面CD16的表达，经由抗体 介导的细胞杀伤作用，间接清除异常细胞。另一方面，供者NK细胞在杀伤细 胞免疫球蛋白样受体(KIR)与受者不相合的情况下，可抑制受者体内淋巴细胞 及树突样细胞的功能，避免移植物抗宿主病(GvHD)的发生。NK细胞在机体 抗感染、抗肿瘤、抗GvHD等多方面发挥着重要作用。基于上述NK的功能， 临床治疗中通过向感染或肿瘤患者回输NK细胞，以达到缓解严重感染或降低 肿瘤负荷的治疗目的。同时，基因修饰NK细胞，如嵌合抗原受体NK细胞 (CAR
‑
NK)、TCR样NK等，亦被广泛研究与应用，以期增强NK细胞的靶向 性及杀伤能力。
[0003]NK细胞为极具治疗潜力的免疫细胞，但其在外周血或脐带血中比例有限— —外周血NK细胞比例在1％～32.6％不等；脐带血NK细胞比例报道高者可达 30％，然而占比在不同供体中差异较大。此外，NK细胞体外扩增困难、体内生 存期短，常规细胞培养方式难以满足临床使用需求，亦难以在体外诱导NK细 胞功能活化。既往采用高剂量IL
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2扩增NK的方式成本高昂，效果有限。为实 现NK细胞体外高效扩增，多种细胞因子组合、细胞因子联合蛋白刺激、细胞 因子联合OKT3、其它化合物(如甲基
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β
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环糊精等)等多种方式均被应用。而 在细胞因子刺激的同时，辅助人工抗原提呈细胞(aAPCs)，即滋养细胞与NK 细胞共培养，被证实可达到NK细胞的有效扩增与功能活化，且已在临床开展 应用。
[0004]aAPCs通常为EBV感染的淋巴细胞系(如，LCL细胞)或K562细胞，其 通过过表达NK细胞活化受体相关配体，促进NK细胞增殖与活化，同时减少外 周血或脐血单个核体系中T细胞的比例。目前，相关过表达配体包括膜结合型 IL15(mIL15)、膜结合型IL21(mIL21)、CD86、CD64、OX40L等。而于NK 细胞而言，其细胞膜表面表达多种类型活化受体，包括NKG2D、2B4/CD244、 DNAM
‑
1/CD226、自然细胞毒性受体(NCR，包括NKp30、NKp44、NKp46) 等。
[0005]在现有技术中，并非所有相关过表达配体都能有效促进NK细胞的增殖， 并且对于外周血或脐带血中NK细胞的定向增殖与功能活化也没有有效的方法。 因此，如何通过不同配体的表达与组合，达到外周血、脐带血以及单一NK细 胞的定向增殖与功能活化，同时延长细胞生存、避免细胞过度活化与耗竭，为 目前NK细胞滋养细胞研究面临的问题，急需寻找一种解决该问题的办法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个方面，是针对现有技术中，外周血、脐带血以及单一NK细 胞体外扩
增有限、活化程度低的问题，提供了一种NK细胞的滋养细胞、其制 备方法和应用。
[0007]本专利技术提供的技术方案为：
[0008]一种NK细胞的滋养细胞，所述滋养细胞表达NK细胞活化相关配体，所述 NK细胞活化相关配体包括膜结合型CD48。
[0009]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，上述膜结合型CD48中的CD48氨 基酸序列过与CD8α中的前导序列、铰链区和跨膜区融合形成前导序列
‑
铰链区
ꢀ‑
CD48
‑
跨膜区顺序的序列表达在上述滋养细胞的表面。
[0010]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，上述铰链区为CD8α中的铰链区； 上述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90
‑
99％同源性 的氨基酸序列：T细胞受体的α或β、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、 CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4
‑
1BB或CD154；
[0011]进一步地，在本专利技术的一个实施方式中，上述跨膜区为CD8α中的跨膜区。
[0012]作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，上述膜结合型CD48的氨基酸序列 如SEQ ID No.3所示，或与其具有90
‑
99％同源性的氨基酸序列。
[0013]在本专利技术的某些实施方式中，上述CD48的氨基酸序列以合适的方式进行随 机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力或表达能力， 而这些突变后的氨基酸序列均包含在本专利技术的保护范围之内。
[0014]由于CD48蛋白含糖磷脂酰肌醇锚定位点(GPIanchor)结构，以膜结合型 或游离型两种形式存在，为构建单纯膜结合型CD48，CD48蛋白不表达第220 位氨基酸(系GPI结构域关键蛋白)。
[0015]为了实现本专利技术的目的，在本专利技术的某些实施方式中，上述CD48可以单独 表达在NK细胞的滋养细胞的表面，也可以与其他NK细胞活化相关配体共同表 达在NK细胞的滋养细胞的表面。
[0016]在本专利技术的某些实施方式中，上述NK细胞活化相关配体还包括选自膜结 合型IL21、CD137L或OX40L中的一种或几种，优选为还包括OX40L。
[0017]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，上述NK细胞活化相关配体至少 包含两种、三种或四种外源性多肽。
[0018]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，上述膜结合型IL21中的IL21序列 通过与CD8α中的前导序列、铰链区和跨膜区融合形成前导序列
‑
铰链区
‑
IL21
‑ꢀ
跨膜区顺序的序列表达在所述滋养细胞的表面。
[0019]更优选地，在本专利技术的一个实施方式中，上述铰链区为CD8α中的铰链区； 上述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90
‑
99％同源性 的氨基酸序列：T细胞受体的α或β、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、 CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4
‑
1BB或CD154；优选 为CD8α中的跨膜区。
[0020]作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，上述膜结合型IL21的氨基酸序列 如SEQIDNo.1所示，或与其具有90
‑
99％同源性的氨基酸序列。
[0021]作为优选，在本专利技术的一个实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞的滋养细胞，其特征在于，所述滋养细胞表达NK细胞活化相关配体，所述NK细胞活化相关配体包括膜结合型CD48；优选地，所述膜结合型CD48中的CD48氨基酸序列通过与CD8α中的前导序列、铰链区和跨膜区融合形成前导序列
‑
铰链区
‑
CD48
‑
跨膜区顺序的序列表达在所述滋养细胞的表面；更优选地，所述铰链区为CD8α中的铰链区；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90
‑
99％同源性的氨基酸序列：T细胞受体的α或β、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4
‑
1BB或CD154；优选为CD8α中的跨膜区；优选地，所述膜结合型CD48的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或与其具有90
‑
99％同源性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的滋养细胞，其特征在于，所述NK细胞活化相关配体还包括选自膜结合型IL21、CD137L或OX40L中的一种或几种，优选为还包括OX40L；优选地，所述膜结合型IL21中的IL21序列通过与CD8α中的前导序列、铰链区和跨膜区融合形成前导序列
‑
铰链区
‑
IL21
‑
跨膜区顺序的序列表达在所述滋养细胞的表面；更优选地，所述铰链区为CD8α中的铰链区；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90
‑
99％同源性的氨基酸序列：T细胞受体的α或β、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4
‑
1BB或CD154；优选为CD8α中的跨膜区；优选地，所述膜结合型IL21的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或与其具有90
‑
99％同源性的氨基酸序列；优选地，所述CD137L的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或与其具有90
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99％同源性的氨基酸序列；优选地，所述OX40L的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或与其具有90
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99％同源性的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的滋养细胞，其特征在于，所述NK细胞活化相关配体包括膜结合型CD48和OX40L，或者所述NK细胞活化相关配体包括膜结合型IL21、CD137L和膜结合型CD48，或者所述NK细胞活化相关配体包括膜结合型IL21、CD137L和OX40L，或者所述NK细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建祥，王敏，谢乐灵，牟俊黎，饶青，徐颖茜，邢海燕，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：