基于RPA-侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种基于RPA

【技术实现步骤摘要】
基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法。

技术介绍

[0002]MON810品系转基因玉米可用于饲料食品的加工原料，其外源基因来源于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD
‑
1菌种(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki HD
‑
1)的Cry1Ab基因，经基因修饰后接入质粒载体PV
‑
ZMBK07中，通过基因枪法实现遗传转化。MON810转化事件的插入序列包含CaMV 35S启动子(299bp)、经修饰的抗虫基因Cry1Ab部分编码区域(2448bp)、玉米热激蛋白基因hsp70的内含子(804bp)。MON810表达的杀虫蛋白是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的杀虫晶体蛋白Cry1Ab，是所有抗虫蛋白中应用最广泛的一种，对欧洲玉米螟、西南玉米螟和亚洲玉米螟等鳞翅目害虫都具有良好抗性，对人类、哺乳动物和其它有益昆虫没有影响。Cry1Ab蛋白的杀虫机制是：该蛋白被昆虫摄入后，在碱性肠道中被活化，专一性与中肠上皮细胞受体结合，形成离子通道或孔洞，引起渗透压失衡，导致昆虫死亡。由于MON810品系在防治玉米螟方面的效果较好，自商业化至今，其种植范围越来越广，但是其食用安全和环境安全问题也越来越受到重视，因此对转基因MON810品系的分析检测至关重要。
[0003]目前针对MON810品系检测的国家标准是定性PCR法，出入境检测检疫行业标准是采用LAMP方法进行检测。这些方法从提取基因组到后续的扩增检测所需的时间都较长，且需要一些专业的仪器设备。
[0004]同时，传统的提取玉米基因组的方法是CTAB法，耗时大约3h。目前利用市面上的各种试剂盒提取玉米DNA也大约需要1
‑
2h，在提取玉米基因组阶段所耗费的时间也比较长。
[0005]重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是在多酶体系下进行的一种恒温体外扩增技术。RPA反应一般在20min左右即可完成，且灵敏度高，特异性强，所需仪器设备简单便携，尤其是2014年RPA商业化试剂盒问世，使得RPA操作更加简便，可满足现场检测的需求。但是由于RPA反应体系组分较复杂，可能会对凝胶成像结果造成一定的影响。

技术实现思路

[0006](一)要解决的技术问题
[0007]为了开发一种快速、便携、灵敏且特异性强的检测转基因玉米MON810的方法，本专利技术提供了一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组和方法。
[0008](二)技术方案
[0009]本专利技术首先提供一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组，其包括以下引物组中的一组或多组：
[0010]引物组I：
[0011]正向引物序列为：5
’‑
TACAACGCCAAGCACGAGAC
‑3’
(SEQ ID No.9)；
[0012]反向引物序列为：5
’‑
ATCTGCTGCAGGTGGTCTTAC
‑3’
(SEQ ID No.10)；
[0013]引物组II：
[0014]正向引物序列为：5
’‑
GCTCAAGGCTTACACTCGCT
‑3’
(SEQ ID No.5)；
[0015]反向引物序列为：5
’‑
AAAGGACCTGACTGCTCGC
‑3’
(SEQ ID No.6)；
[0016]引物组III：
[0017]正向引物序列为：5
’‑
AGCTCAAGGCTTACACTCGC
‑3’
(SEQ ID No.7)；
[0018]反向引物序列为：5
’‑
TGACTGCTCGCAAGCAAATTC
‑3’
(SEQ ID No.8)。
[0019]本专利技术经过大量的优化和筛查后发现，上述引物即使在所提基因组的产量和纯度有所损失的情况下，也能通过RPA反应很好地实现对目标基因的扩增，进而有利于减少实际检测时的提取工序和提取时间，提升对转基因玉米MON810的检测效率。
[0020]作为优选，当所述正向引物的5
’
端修饰有iSp18，在iSp18的另一端连接有序列为TTTTTTTTTTTTTTT(SEQ ID No.13)的核酸分子；所述反向引物的5
’
端修饰有FITC时，更有利于后续侧流层析技术中的检测效果。
[0021]具体的，以引物组I为例，其修饰后的正向引物的序列如下：
[0022]5’‑
TTTTTTTTTTTTTTT/iSp18/TACAACGCCAAGCACGAGAC
‑3’
；
[0023]修饰后的反向引物的序列如下：
[0024]5’‑
/FITC/
‑
ATCTGCTGCAGGTGGTCTTAC
‑3’
。
[0025]进一步的，本专利技术还提供一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的试剂盒，其包括所述的引物组。
[0026]进一步的，本专利技术还提供所述的引物组或所述的试剂盒在检测转基因玉米MON810中的应用。
[0027]进一步的，本专利技术提供一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的方法，其包括以下步骤：
[0028]1)提取待测玉米的DNA；
[0029]2)以所提DNA为模板，使用所述的引物组进行RPA扩增；
[0030]3)通过侧流层析技术对RPA扩增产物进行检测。
[0031]作为优选，在步骤1)中，利用Wizard magnetic DNA purification system for food试剂盒中的试剂提取待测玉米的DNA，具体包括：
[0032]以100mg待测玉米的粉末为计算基准(在实际操作时可等比例放大或缩小)，将其与490
‑
510μL Lysis buffer A和4
‑
6μLRNaseA混合，大力晃动8
‑
15s；而后加入240
‑
260μL Lysis buffer B并大力晃动8
‑
15s，在室温放置0.8
‑
1.2min后，加入740
‑
760μL Precipitation solution，大力晃动8
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的引物组，其特征在于，其包括以下引物组中的一组或多组：引物组I：正向引物序列为：5
’‑
TACAACGCCAAGCACGAGAC
‑3’
；反向引物序列为：5
’‑
ATCTGCTGCAGGTGGTCTTAC
‑3’
；引物组II：正向引物序列为：5
’‑
GCTCAAGGCTTACACTCGCT
‑3’
；反向引物序列为：5
’‑
AAAGGACCTGACTGCTCGC
‑3’
；引物组III：正向引物序列为：5
’‑
AGCTCAAGGCTTACACTCGC
‑3’
；反向引物序列为：5
’‑
TGACTGCTCGCAAGCAAATTC
‑3’
。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述正向引物的5
’
端修饰有iSp18，在iSp18的另一端连接有序列为TTTTTTTTTTTTTTT的核酸分子；所述反向引物的5
’
端修饰有FITC。3.一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的引物组。4.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在检测转基因玉米MON810中的应用。5.一种基于RPA
‑
侧流层析技术检测转基因玉米MON810的方法，其特征在于，其包括以下步骤：1)提取待测玉米的DNA；2)以所提DNA为模板，使用权利要求1或2所述的引物组进行RPA扩增；3)通过侧流层析技术对RPA扩增产物进行检测。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，利用Wizard magnetic DNA purification system for food试剂盒中的试剂提取待测玉米的DNA，具体包括：以100mg待测玉米的粉末为计算基准，将其与490
‑
510μL Lysis buffer A和4
‑
6μLRNaseA混合，大力晃动8
‑
15s；而后加入240
‑
260μL Lysis buffer B并大力晃动8
...

【专利技术属性】
技术研发人员：程楠，张倩，贺晓云，许文涛，黄昆仑，罗云波，刘清亮，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：