一种芋螺抗皱素的制备方法技术

本发明专利技术涉及多肽药物制备技术领域，公开了一种芋螺抗皱素的制备方法，该方法包括以下步骤：在固相载体上，按照芋螺抗皱素肽序采用固相合成方法得到芋螺抗皱素全保护肽树脂；芋螺抗皱素全保护肽树脂经裂解试剂裂解，得到芋螺抗皱素线性肽；芋螺抗皱素线性肽经环化液环化后，得到芋螺抗皱素粗品，其中，环化液体系的pH范围为5～7.9；芋螺抗皱素粗品经纳微PS40柱纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到醋酸芋螺抗皱素。本发明专利技术工艺通过选择合适的裂解体系、环化体系和纯化体系，可以有效解决Cys在裂解及环化过程中发生的Cys

【技术实现步骤摘要】
一种芋螺抗皱素的制备方法


[0001]本专利技术涉及多肽药物制备
，特别涉及一种芋螺抗皱素的制备方法。

技术介绍

[0002]芋螺毒素(conotoxin)由海洋软体动物芋螺(Conus)的毒腺分泌，是12
‑
20个氨基酸长度的小肽毒素分子，主要是一些对多种离子通道和神经受体具有高度专一性的活性多肽，能特异性地作用于乙酰胆碱受体及其他神经递质的各种受体亚型，及钙、钠、钾等多种离子通道。根据芋螺毒素基因及其前体蛋白信号肽的保守性，可将芋螺毒素分为A、O、T、M、P、I等多个超家族；根据毒素作用于生物体内的不同靶位可分为α、ω、μ、δ等多种亚型。
[0003]芋螺抗皱素(或μ
‑
芋螺毒素Cn IIIC，来自超M家族)是一种经过排序、人工合成的高度折叠的胜肽，以高亲和力和特异性靶向多样的分子实体，模拟芋螺毒素，穿透力强，稳定性高，目标性的针对肌肉达到放松的作用。μ
‑
芋螺毒素家族的特征是保守的半胱氨酸模式，导致受限的三级结构，并导致与钠通道的相互作用。大多数μ
‑
芋螺毒素优先靶向肌肉型电压门控钠通道(VGSC)，对神经元VGSC的选择性较低。芋螺抗皱素的作用靶点为细胞表达重组钠通道
‑
肌肉型钠离子阀门通道Nav1.4(骨骼肌)，与受体紧密结合，调控突触信号，产生传导阻滞作用，使电信号无法传递至肌肉及节细胞，导致神经肌肉系统功能丧失，阻止肌肉收缩，从而让肌肉放松下来。
[0004]芋螺抗皱素具有非常强效的肌肉松弛作用，从而达到即时的抗皱效果，更高效地抑制动态纹。在各种抗衰老的个人护理品中均可应用。在护肤品配方中，加入如精华液、乳液、面霜及面膜等，从而达到祛除深层皱纹的理想效果。加入眼部护理中可明显去除眼周皱纹和眼角鱼尾纹；面部护理中可明显去除由于肌肉收缩而产生的抬头纹、法令纹等。
[0005]芋螺抗皱素，英文名为Mu
‑
conotoxin，具体肽序如下：Pyr1‑
Gly2‑
Cys3‑
Cys4‑
Asn5‑
Gly6‑
Pro7‑
Lys8‑
Gly9‑
Cys
10
‑
Ser
11
‑
Ser
12
‑
Lys
13
‑
Trp
14
‑
Cys
15
‑
Arg
16
‑
Asp
17
‑
His
18
‑
Ala
19
‑
Arg
20
‑
Cys
21
‑
Cys
22
‑
CONH2,Cyclic(3
→
15),(4
→
21),(10
→
22)tris(disulfide)
[0006]目前获取芋螺毒素的方法主要有3种：从野生芋螺毒管中直接分离获得；通过转基因生物法合成；采用固相多肽合成法合成。其中，天然产物提取产量受限，从芋螺体内直接分离提取芋螺毒素的工艺复杂，提取困难，成本高；生物法合成工艺并不成熟，两者均难以实现芋螺毒素的产业化，并不能满足市场的需求。因此，需要通过固相多肽合成法大量合成，降低成本，以此满足科研用途及日益增长的市场需求。
[0007]芋螺抗皱素主链有22个氨基酸，其中有6个Cys，3对二硫键，其结构导致制备过程中若未选择合适的条件，容易发生副反应，进而对产品的收率、分离纯化的难度、产品质量等产生较大的影响。专利CN110894225A公开了一种芋螺抗皱素的规模化制备方法，该方法按照芋螺抗皱素主链C端至N端的氨基酸顺序依次偶联肽树脂，裂解后采用空气氧化法合成三对二硫键，最后纯化制备得到产品。该专利在裂解时使用EDT，容易导致Cys
‑
EDT的加成副反应的发生；环化体系中pH范围选择8.0
‑
10.0，然而芋螺肽裂解后得到的线性肽等电点为8.14，所以当环化液pH大于8.0时非常容易析出固体，不利于二硫键成环，产率低下。
[0008]因此，需要设计合理的制备路线来减少上述副反应的发生，提高粗肽纯度、降低制备的难度，从而提高总收率、降低总成本。

技术实现思路

[0009]本专利技术针对现有技术在合成过程中存在副反应多，纯化难，收率低，纯度低的问题，提供了一种芋螺抗皱素的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0010]步骤1：在固相载体上，按照芋螺抗皱素肽序采用固相合成方法在碱或者缩合剂存在下进行逐步缩合或片段偶联，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂；
[0011]步骤2：将步骤1制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到芋螺抗皱素线性肽；
[0012]步骤3：将步骤2制得的芋螺抗皱素线性肽经环化液环化后，得到芋螺抗皱素粗品；其中，环化液体系的pH范围为5～7.9；
[0013]步骤4：将步骤3制得的芋螺抗皱素粗品经纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到芋螺抗皱素精肽。
[0014]进一步地，所述步骤1具体为：在碱或者缩合剂存在下，将固相载体依次与Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Arg(pbf)
‑
OH、Fmoc
‑
Ala
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OH、Fmoc
‑
His(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Asp(OtBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Arg(pbf)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Trp(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Lys(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Lys(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Pro
‑
OH、Fmoc
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Asn(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
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Cys(Trt)
‑
OH、Fm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：步骤1：在固相载体上，按照芋螺抗皱素肽序采用固相合成方法在碱或者缩合剂存在下进行逐步缩合或片段偶联，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂；步骤2：将步骤1制得的芋螺抗皱素全保护肽树脂经裂解试剂裂解后，得到芋螺抗皱素线性肽；步骤3：将步骤2制得的芋螺抗皱素线性肽经环化液环化后，得到芋螺抗皱素粗品；其中，环化液体系的pH范围为5～7.9；步骤4：将步骤3制得的芋螺抗皱素粗品经纯化、转盐、浓缩、冷冻干燥，得到芋螺抗皱素精肽。2.根据权利要求1所述的一种芋螺抗皱素的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：在碱或者缩合剂存在下，将固相载体依次与Fmoc
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Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
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Arg(pbf)
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OH、Fmoc
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Ala
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OH、Fmoc
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His(Trt)
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OH、Fmoc
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Asp(OtBu)
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OH、Fmoc
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Arg(pbf)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
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OH、Fmoc
‑
Trp(Boc)
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OH、Fmoc
‑
Lys(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Ser(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Lys(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Pro
‑
OH、Fmoc
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Asn(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Gly
‑
OH、H
‑
Pyr
‑
OH进行缩合，得到芋螺抗皱素全保护肽树脂：Pyr
‑
Gly
‑
Cys(Trt)
‑
Cys(Trt)
‑
Asn(Trt)
‑
Gly
‑
Pro
‑
Lys(Boc)
‑
Gly
‑
Cys(Trt)
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建松，支钦，吴昊，郑飞，
申请(专利权)人：深圳市健元医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：