一种在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法及其应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，公开了一种在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法及其应用，该方法是将处于3～20代的细胞转移孔板中，得到诱导细胞；将处于对数增长期的细菌经缓冲液洗涤，改性细胞培养液重悬，得到细菌悬液。将细菌悬液加入诱导细胞中，在恒温培养箱中孵育1～5h后，后加入含10～500mg/L庆大霉素改性细胞培养液，经细胞处理3～10d后，加入细胞裂解液收集胞内的细菌再洗涤、离心、重悬，得到活的不可培养状态的细菌。本发明专利技术在宿主细胞存在条件下可以诱导细菌进入活的不可培养状态，不仅拓展了对活的不可培养状态细菌的认识，也为临床中的复发性、慢性感染疾病提供理论与技术支持。感染疾病提供理论与技术支持。感染疾病提供理论与技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，更具体地，涉及一种在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法及其应用。

技术介绍

[0002]活的不可以培养状态细菌是细菌应对贫营养、低温、低pH值、高盐度、抗生素等不利环境压力的一种生存策略，其主要特征是不能在营养丰富的非选择性细菌培养基上形成菌落，但仍然保持了细菌的结构完整性(蛋白质、细胞壁、核酸)及其代谢活性，活的不可培养状态细菌不仅对不适环境耐受能力提高，表现出对抗生素具有耐药性，而且在适宜的条件下，活的不可培养细菌可能还会恢复成为可培养性的细菌并保留其危害性。
[0003]多数情况下，宿主免疫系统可以消灭入侵的细菌。然而在某些感染中，细菌可能会逃避宿主免疫系统的攻击并在宿主内持续存在。此外，细胞胞内环境是复杂的，比如贫营养、低pH、一氧化氮、ROS、抗菌肽，这些不利因素长期作用于细菌，细菌可以逐渐转变适应性方式(变成活的不可培养状态)在细胞内宿主环境中生存，这种细胞内的活的不可培养细菌可以逃避免疫识别、细胞外宿主防御和细胞外的抗生素作用。另外，处于活的不可培养状态的细菌的耐受性增加，并且随着细胞分裂，细胞的胞吐作用导致细菌再次释放到细胞外的某处适宜环境中，导致活的不可培养细菌再次复苏，恢复其原有危害性。由于人体内存在活的不可培养状态细菌，这将导致病原体的无症状携带，会延长致病细菌的潜伏期，并且在抗生素治疗期间躲避攻击从而使得细菌继续存活，可对公众健康构成一定的危害。因此，非常有必要深入探究宿主细胞中活的不可培养细菌的演化机制。。

技术实现思路

[0004]为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法。通过调节不同细胞和细菌种类，不同细胞数量，不同细菌浓度，作用时间，庆大霉素浓度等条件，从而稳定得到活的不可培养细菌。为临床研究活的不可培养细菌的毒性、耐药性等提供一个模型方法，并为临床中的复发性、慢性感染疾病提供一定的理论与技术支持。细胞诱导细菌进入活的不可培养状态的方法可以很好地了解人体细胞中的长期内细菌存活及其演化的情况。使用该模型不仅可以快速、稳定诱导获得活的不可培养状态细菌，还可以拓展对活的不可培养细菌的新认识，从而可以进一步阐明活的不可培养状态细菌在细胞内的生存及其演化机制。
[0005]本专利技术的另一个目的在于提供上述方法诱导的活的不可培养状态细菌，进一步阐明其在宿主细胞内的形成机制。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案来实现：
[0007]S1.将细胞融合度为70～90％的细胞培养液吸弃，用缓冲液洗涤，胰蛋白酶消化，收集细胞，通过细胞计数确定细胞的浓度，再将所得细胞转移至不同规格的细胞培养皿中，
后置于培养箱中培养，得到诱导细胞；
[0008]S2.将过夜培养的细菌收集，经缓冲液洗涤和离心，后加入改性细胞培养液重悬，使用酶标仪调节细菌的OD值等于细菌的浓度值，将已知浓度的细菌通过梯度稀释得到细菌悬液；
[0009]S3.在超净工作台内，将步骤S2中细菌悬液加入到诱导细胞中，经离心使细菌充分进入细胞内，随后转移至10～60℃，0.5～30％CO2的恒温培养箱中孵育1～5h；
[0010]S4.培养皿中在超净工作台内，去除步骤S3细胞培养皿中的细菌悬液，并用缓冲液洗涤，后加含浓度为50～500mg/L庆大霉素的细胞培养液，置于培养箱中孵育，再吸弃培养液，随后加入含浓度为10～100mg/L庆大霉素的细胞培养液，以防止被感染死细胞释放的细菌再次感染，通过光学显微镜监测细胞情况，及时更换细胞培养液；
[0011]S5.在细胞作用3～10天后收集诱导细胞内的细菌，首先移除细菌悬液，并用缓冲液洗涤，再加入0.1～10wt％的SDS细胞裂解液，室温孵育，释放出胞内细菌，加入缓冲液洗涤，经离心，洗涤，缓冲液重悬，得到活的不可培养状态细菌。
[0012]优选的，步骤S1中细胞为第3～20代细胞系，细菌处于对数增长期。
[0013]优选的，步骤S1所述细胞为人体细胞中的16HBE、Base
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2B或HaCaT，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌中的一种以上。
[0014]优选的，步骤S1和S4中所述细胞培养液均为细胞基础培养液、FBS和青霉素
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链霉素，细胞基础培养液的含量为30～99.9wt％，FBS在细胞基础培养液中的含量为0.05～50wt％，青霉素
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链霉素在细胞基础培养液中的含量为0.05～5wt％，所述细胞基础培养液为DMEM、RPMI1640、MEM或F
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12K。
[0015]优选的，步骤S2中所述改性细胞培养液为细胞基础培养液和FBS；细胞基础培养液的含量为30～99.95wt％，FBS在细胞基础培养液中的含量为0.05～50wt％；；细胞基础培养液为DMEM，RPMI1640，MEM，F
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12K。
[0016]优选的，步骤S1中所述细胞的浓度为104～107cell/well，骤S2中所述细菌悬液浓度为104～108CFU/mL。
[0017]优选的，步骤S2中所述离心的转速为500～2000rpm，离心的时间为5～30min。
[0018]优选的，步骤S1～S5所述缓冲液为无菌磷酸盐缓冲液。
[0019]所述的活的不可培养状态细菌是由所述方法制得。
[0020]所述的诱导形成活的不可培养状态细菌方法的在评估临床中复发性和慢性感染疾病中的应用。
[0021]本专利技术提供了在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法，并通过实验能够证明宿主细胞内存在诱导形成活的不可培养状态细菌，给公共卫生安全带来巨大隐患。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]1.本专利技术首次采用人体宿主细胞诱导细菌进入活的不可培养状态，通过选择不同规格细胞培养皿设计不同细胞数量，调整不同细菌浓度，细胞与细菌的作用时间，操作简单、快捷，稳定获得活的不可培养细菌的概率很高。
[0024]2.本专利技术中在诱导过程中加入含庆大霉素的细胞培养液，不仅可以去除胞外细菌，防止诱导过程中细菌的二次感染，还能维持细胞的正常活性。
[0025]3.本专利技术可以将能进入活的不可培养状态的病原体细菌(已经有文献证明这些菌能在模拟环境下以及临床和环境样本中进入活的不可培养状态)暴露于人体宿主细胞。真实模拟环境中的病原菌进入人体细胞后，在抗生素治疗过程中产生的健康风险，即在抗生素治疗过程中，病原菌以活的不可培养状态在人体细胞内生存，可能导致抗生素的治疗失败以及复发性感染。
[0026]4.本专利技术很容易将宿主细胞组分与活的不可培养细菌分离，可以单独表征活的不可培养细菌的形状，从细菌角度阐明活的不可培养状态的形成机制。
[0027]5.本专利技术可以为临床本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将细胞融合度为70～90％的细胞培养液吸弃，用缓冲液洗涤，胰蛋白酶消化，收集细胞，通过细胞计数确定细胞的浓度，再将所得细胞转移至不同规格的细胞培养皿中，后置于培养箱中培养，得到诱导细胞；S2.将过夜培养的细菌收集，经缓冲液洗涤和离心，后加入改性细胞培养液重悬，使用酶标仪调节细菌的OD值等于细菌的浓度值，将已知浓度的细菌通过梯度稀释得到细菌悬液；S3.在超净工作台内，将步骤S2中细菌悬液加入到诱导细胞中，经离心使细菌充分进入细胞内，随后转移至10～60℃，0.5～30vol％CO2的恒温培养箱中孵育1～5h；S4.培养皿中在超净工作台内，去除步骤S3细胞培养皿中的细菌悬液，并用缓冲液洗涤，加入含浓度为10～500mg/L庆大霉素的细胞培养液，置于培养箱中孵育，再吸弃培养液，随后加入含浓度为10～500mg/L庆大霉素的细胞培养液，以防止被感染死细胞释放的细菌再次感染，通过光学显微镜监测细胞情况，及时更换细胞培养液；S5.在细胞作用3～10天后收集宿主细胞内的细菌，首先移除细菌悬液，并用缓冲液洗涤，再加入0.1～10wt％的SDS细胞裂解液，室温孵育释放出胞内细菌，加入缓冲液洗涤，经离心，洗涤，缓冲液重悬，得到活的不可培养状态细菌。2.根据权利要求1所述的在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法，其特征在于，步骤S1中细胞为第3～20代细胞系，细菌处于对数增长期。3.根据权利要求1所述的在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细菌的方法，其特征在于，步骤S1所述细胞为人体细胞中的16HBE、Base
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2B或HaCaT，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌中的一种以上。4.根据权利要求1所述的在宿主细胞存在条件下诱导形成活的不可培养状态细...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂英，刘琴，蔡仪威，安太成，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：