一种脊尾白虾抗菌肽及其重组蛋白的制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种脊尾白虾抗菌肽及其重组蛋白的制备方法与应用，包含具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列；所述脊尾白虾抗菌肽的基因EcCrustin，包含具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列；本发明专利技术的EcCrustin的核酸序列长378bp，开放阅读框架编码125个氨基酸，推测蛋白分子量大小为13.9KDa，重组蛋白表达载体pET

【技术实现步骤摘要】
一种脊尾白虾抗菌肽及其重组蛋白的制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种脊尾白虾抗菌肽及其重组蛋白的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]渔业作为现代农业重要组成部分，是保障优质蛋白供给和食品安全的重要物质基础。近年来，随着高密度、工厂化、集约化养殖模式的建立及推广，病害频发已成为制约水产健康养殖的重要因素之一。例如各种细菌性疾病的爆发会引起大量水产养殖动物死亡，从而给水产养殖业带来巨大经济损失。目前行业内主要采用抗生素类药物来预防和治疗水产动物的细菌性疾病，虽然抗生素具有强效的杀菌作用，但其在抑制或杀灭病原微生物的同时会抑制某些有益微生物，破坏水产动物体内外生态平衡。长期滥用抗生素还会致使病菌产生耐药性，违背了绿色健康养殖理念。因此亟待开发可用于水产养殖的绿色、健康、安全的新型渔药，以减少或替代抗生素类药物的使用。
[0003]抗菌肽(Antimicrobial peptides)来源于动物自身，作为体液免疫中一种重要的免疫分子，在先天性免疫防御中有着非常重要的作用，它不仅可以抑制或杀灭多种病原体，也可以激发机体的其他抗病免疫相关反应，具有广谱杀菌、热稳定性好、不易使细菌产生耐药性等特点，是最有可能替代抗生素成为新一代相对安全的抗菌药物。
[0004]甲壳动物中的抗菌肽主要包括三种：penaeidins，Crustin(甲壳肽)和ALF(抗脂多糖因子)，上述三种抗菌肽都是阳离子抗菌肽，具有抗菌或抗病毒活性。另外在甲壳动物中还发现了许多抗菌功能的小肽，比如对虾血蓝蛋白断裂片段等等。
[0005]目前已经有许多甲壳动物的抗菌肽基因被发现并公布在NCBI(美国国立生物技术信息中心)上，但是本专利技术涉及到的抗菌肽基因EcCrustin为本专利技术人首次发现且命名，在NCBI或者相关文献中没有关于其重组蛋白应用的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种脊尾白虾抗菌肽及其重组蛋白的制备方法与应用，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种脊尾白虾抗菌肽，具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列；所述脊尾白虾抗菌肽的基因EcCrustin，包含具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，将基因EcCrustin表达序列连接到原核表达载体pET
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22b中，得到表达载体Pet
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22b
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EcCrustin。
[0009]一种脊尾白虾抗菌肽重组蛋白的制备方法，具体步骤如下：将脊尾白虾抗菌肽的基因EcCrustin转化到表达载体BL21中进行蛋白表达、纯化，获得凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白。
[0010]一种脊尾白虾抗菌肽的应用，脊尾白虾抗菌肽在抗菌药物、疫苗、饲料添加剂中的
应用。
[0011]一种脊尾白虾抗菌肽抗菌效果的检测方法，利用分子生物学手段敲低EcCrustin基因，检测其抑菌效果。
[0012]本专利技术的有益效果是：本专利技术的EcCrustin的核酸序列长378bp，开放阅读框架编码125个氨基酸，推测蛋白分子量大小为13.9KDa，重组蛋白表达载体pET
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22b
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Crustin转化到大肠杆菌BL21可以获得稳定的表达EcCrustin重组蛋白的菌株；采用本专利技术制备的表达菌株以及其表达的重组抗菌肽蛋白具有良好的抗菌效果，可应用于水产动物抗菌药物、疫苗或饲料添加剂。
附图说明
[0013]图1为本专利技术的Pet
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22b
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EcCrustin重组质粒图谱；
[0014]图2为本专利技术EcCrustin重组载体构建SDS
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PAGE电泳及WesternBlot实验结果图；
[0015]A：泳道M为蛋白marker，泳道1为未添加IPTG，泳道2
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4加入0.2mM、0.4mM和0.6mM浓度IPTG；
[0016]B：泳道M为蛋白marker，泳道3为Western blot结果；
[0017]C：泳道M：Protein Marker；泳道1：破碎后沉淀；泳道2：破碎后上清；泳道3：流出液；泳道4：清洗样；泳道5：洗脱样成功表达目的蛋白并进行纯化。
[0018]图3为本专利技术病原物刺激后EcCrustin在血淋巴中的表达模式图；
[0019]A：脂多糖、B：副溶血弧菌、C：磷壁酸、D：金黄色葡萄球菌；
[0020]在外界病原物刺激后，EcCrustin在血淋巴中均呈现上调趋势，说明在病原物入侵时EcCrustin在机体免疫中发挥了一定的作用。
[0021]图4为本专利技术EcCrustin基因的干扰效率验证图；
[0022]通过注射5μL siRNA后对EcCrustin基因进行定量检测，观察表达量变化趋势确定干扰效率，在6小时后表达量有显著下降的趋势，干扰效率约为50％。
[0023]图5为本专利技术在敲低EcCrustin后脊尾白虾在副溶血弧菌刺激下的存活率图；siRNA：5μL siRNA；V.p：副溶血弧菌；Saline：生理盐水；
[0024]在敲低EcCrustin后，相较于未被干扰虾，受副溶血弧菌刺激的脊尾白虾后存活率显著下降；
[0025]图6为本专利技术EcCrustin重组蛋白最小抑菌浓度图；
[0026]EcCrustin重组蛋白复性后在体外对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有明显的抑制功能。
具体实施方式
[0027]下面结合附图对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0028]请参阅图1
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6，本专利技术提供一种技术方案：一种脊尾白虾抗菌肽，具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列；所述脊尾白虾抗菌肽的基因EcCrustin，包含具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列。
[0029]一种脊尾白虾抗菌肽重组蛋白的制备方法，具体步骤如下：将脊尾白虾抗菌肽的
基因EcCrustin转化到表达载体BL21中进行蛋白表达、纯化，获得凡纳滨对虾抗菌肽重组蛋白。
[0030]一种脊尾白虾抗菌肽的应用，脊尾白虾抗菌肽在抗菌药物、疫苗、饲料添加剂中的应用。
[0031]一种脊尾白虾抗菌肽抗菌效果的检测方法，利用分子生物学手段敲低EcCrustin基因，检测其抑菌效果。
[0032]实施例1：
[0033]1、EcCrustin基因的克隆；
[0034]选取健康的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作为实验材料，根据脊尾白虾转录组数据设计引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脊尾白虾抗菌肽，其特征在于：包含具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列；所述脊尾白虾抗菌肽的基因EcCrustin，包含具有与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列至少95％同源性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种脊尾白虾抗菌肽，其特征在于：将基因EcCrustin表达序列连接到原核表达载体pET
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22b中，得到表达载体Pet
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22b
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【专利技术属性】
技术研发人员：胡广伟，徐凯，刘栋，王超，王伟丽，刘德雪，高焕，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：