本发明专利技术公开了一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法，结合基于Fiji(ImageJ)的信号点位置提取以及基于MATLAB的信号点强度提取，对大量smFRET原始数据进行简便、高效的分析。该方法相对于基于IDL或(和)MATLAB的smFRET分析算法，使用门槛较低，算法简单，且对输入图像格式要求较为宽松，能够批量、高效地对smFRET原始数据进行处理；通过高效分析获得大量的smFRET数据保证了FRET状态分析的可靠性。本发明专利技术对smFRET数据的高效处理具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法
[0001]本专利技术涉及分析单分子荧光共振能量转移信号的方法，具体涉及一种基于Fiji(ImageJ)和MATLAB算法提取信号点信息并分析单分子荧光共振能量转移状态的方法。
技术介绍
[0002]单分子生物物理技术克服了传统生物学研究手段无法提供个体差异信息和时间维度信息的缺点，发展成为研究生物分子活动的有力工具。荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)技术是基于两个荧光分子在空间距离很近时产生的一种能量转移现象而发展的成像方法，其实现主要依赖一对荧光发色的基团(供体和受体荧光团)：当两个荧光团的空间位置足够靠近时(<10nm)，供体基团吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现能量向邻近受体分子的转移。FRET可以作为“光谱标尺”提供供体荧光团和受体荧光团之间的距离信息。单分子技术与FRET技术的结合产生了单分子荧光共振能量转移(single
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molecule FRET，smFRET)技术。smFRET是目前在水溶液中研究生物分子动态行为的重要单分子技术之一，可以在纳米尺度提供单个生物分子内部或分子间的空间信息。近二十年来，smFRET已被全世界多个研究团队使用来研究各种各样的生物体系，包括DNA、RNA、蛋白以及生物分子复合物等。
[0003]尽管smFRET技术自其被开发以来已经获得了广泛应用，但是smFRET数据的分析仍然是研究者关注的重点问题之一。一方面，背景噪点及非单分子荧光信号的存在会干扰smFRET信号点的分析，能否在这些信号的干扰下提取出真实的单分子信号决定了后续分析的质量；另一方面，从原始的smFRET信号提取出特定条件下的FRET状态往往需要大量数据的支撑，这使得高效的数据分析方法成为必然。已有的smFRET分析方法因实验团队而异：基于IDL(Interactive Data Language)编写脚本进行信号点提取是使用较多的方法之一，例如smFRET领域的权威专家Taekjip Ha团队提供了一种使用IDL脚本提取信号点并使用MATLAB进行后续分析的完整分析方案，但其算法较为复杂且涉及IDL及MATLAB两种编程语言，所使用的IDL脚本对图像采集方式、输入文件格式及图像大小有严格限制，并且未实现对多组smFRET原始图像的连续、高效的信号提取；此外，有工作基于MATLAB对信号点进行提取(例如，SPARTAN)，但一次只能处理一组smFRET原始图像，不能进行连续、高效的分析。
技术实现思路
[0004]针对现有分析方法算法复杂且不能对大量smFRET数据进行高效分析的缺点，本专利技术基于Fiji(ImageJ)和MATLAB开发了一种分析smFRET数据的新方法。Fiji(ImageJ)是被科研人员广泛使用的开源图像处理软件，使用门槛较低且对输入图像格式要求较为宽松，结合ImageJ宏(macro)语言的使用可以批量处理多个smFRET图像；本专利技术提供的MATLAB算法也较为简便，可以实现对smFRET信号的自动、高效筛选以及FRET状态的分析。本专利技术基于ImageJ和MATLAB开发，旨在提供一种可以简便、高效分析smFRET数据的方法。
[0005]本专利技术提供的技术方案如下：
[0006]一种简便、高效地对smFRET原始数据进行信号提取并基于大量数据进行FRET状态分析的方法，包括以下步骤：
[0007]1)使用ImageJ对采集的smFRET荧光信号原始图像进行预处理并提取信号点位置：
[0008]1a.预处理：
[0009]本专利技术使用光分离系统如DV2
‑
CUBE(ET585/65M，635LPXR，ET655LP，Photometrics)分离FRET的双通道信号，获得供体(donor)如ATTO550和受体(acceptor)如ATTO647N的荧光信号合并在一起的原始smFRET图像(以2000帧为例，前1000帧对应收集的受体信号，后1000帧对应收集的供体信号)。为了便于后续处理，首先使用“Make Substack”将原始图像按受体和供体通道分别提取为acceptor.tif和donor.tif；分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Subtract Background”(减背景信号处理)以降低背景信号对真实信号强度的影响，并另存为“Image Sequence”以便后续在MATLAB中进行处理。其中，“Subtract Background”处理的rolling ball radius(滚动半径)优选在10～50像素范围内，在本专利技术的一个实施例中，rolling ball radius＝30pixels。
[0010]1b.提取信号点位置：
[0011]为了获得一次拍摄过程中所有被激发的荧光分子信号位置，首先分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Z project”(“Max Intensity”模式)，该处理将每个像素在所有帧中最大的信号强度赋值给该像素，得到一张2D的Z投影图，包含了所有在拍摄过程中出现过的荧光分子信号。
[0012]为了提取供体荧光信号点的位置，首先需要设置一定的阈值以去除大部分背景噪声：
①
为了提高信噪比以提高设置阈值对信号和背景的区分能力，先使用“Find Edges”处理供体通道的Z投影图，该项处理可以突出信号变化强烈的边界信号而降低在空间上无明显信号强度变化的背景区域信号强度；
②
其后使用“Threshold”设置阈值以选择适当强度范围内的信号。
③
阈值设置后，使用“Analyze Particles”(size＝9
‑
49，circularity＝0.90
‑
1.00，show＝[Count Masks]，display exclude summarize)对选中的信号点进行分析(size值与使用的荧光团和实验条件有关，本专利技术实验例的条件下单分子信号的大小一般为9
‑
49pixel^2，可根据具体实验进行调整；circularity的取值范围在0
‑
1，0对应分析的目标particle为线形，1对应分析的目标particle为圆形。由于衍射，单分子在图像上往往呈现为一个高斯信号点，因此将circularity设置为0.90
‑
1.00，从而仅分析近似为圆形的信号点，筛除非高斯噪点以及聚集在一起的信号)。该步骤最终生成一张仅保留目标信号点而其他像素值为0的Mask图。
④
对得到的Mask图做“Find Maxima”(prominence＝0，strict exclude，output＝List)，得到每个目标信号点的位置坐标，将得到的坐标列表另存为pos.csv文件本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种对单分子荧光共振能量转移信号进行分析的方法，包括以下步骤：1)使用ImageJ软件对采集的smFRET原始图像进行预处理并提取信号点位置，包括：1a)预处理：使用“Make Substack”将smFRET原始图像按受体和供体通道分别提取为acceptor.tif和donor.tif；分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Subtract Background”处理以降低背景信号对真实信号强度的影响，并另存为“Image Sequence”；1b)提取信号点位置：首先，分别对acceptor.tif和donor.tif的所有帧做“Z project”处理，将每个像素在所有帧中最大的信号强度赋值给该像素，分别得到一张2D的受体通道和供体通道的Z投影图；接着，使用“Find Edges”处理供体通道的Z投影图以突出信号变化强烈的边界信号而降低在空间上无明显信号强度变化的背景区域信号强度，然后使用“Threshold”设置阈值选择适当强度范围内的信号，再使用“Analyze Particles”对选中的信号点进行分析，生成一张仅保留目标信号点而其他像素值为0的Mask图；对得到的Mask图做“Find Maxima”处理，得到每个目标信号点的位置坐标，将得到的坐标列表另存为pos.csv文件；同时，对供体通道和受体通道的Z投影图分别做“Subtract Background”处理，分别另存为donor_ref.tif和acceptor_ref.tif；2)使用MATLAB算法提取信号点强度信息并进行FRET状态分析，包括：2a)提取信号点强度信息：以donor_ref.tif作为参考图，对pos.csv中的供体信号点位置坐标进行校正，然后以校正后的信号点位置为中心，计算相应供体信号点位置的信号强度随时间的变化轨迹；以acceptor_ref.tif作为参考图，在校正后的供体信号点位置周围寻找受体信号点最强的坐标位置，以该位置为中心，计算其周围的受体信号强度平均值，得到与每个供体信号点对应的受体信号的强度随时间的变化轨迹；2b)FRET状态分析：对供体信号强度进行阶梯函数形式的拟合，在该拟合下，一个ste...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈匡时，吴若楠，秦金珊，应亚宸，杨艳涛，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：
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