一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，S1：EGF间充质干细胞培养，获得含量为90％的EGF间充质干细胞培养液；S2：将第4代脐带间充质干细胞培养液，进行离心，弃上清液，加10mLPBS重悬；S3：将步骤S2中的细胞液通过ExoQuickPre

【技术实现步骤摘要】
一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法


[0001]本专利技术涉及一种纯化方法，特别涉及一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，属于EGF间充质干细胞


技术介绍

[0002]间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。
[0003]根据中国专利号为“CN114134109A”公开了一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，包括如下步骤：步骤1：将含有EGF间充质干细胞外泌体的细胞培养液离心，取上清液；步骤2：将步骤1中收集的上清液用切向流超滤系统过滤浓缩，得浓缩液；步骤3：将步骤2中的浓缩液用阴离子交换层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液；步骤4：将步骤3中收集的洗脱峰溶液用肝素亲和层析柱分离纯化，收集洗脱峰溶液，即得所述EGF间充质干细胞外泌体。该方法能够特异性分离提纯EGF间充质干细胞外泌体，可有效分离携带EGF蛋白和未携带EGF蛋白的外泌体，提取的EGF间充质干细胞外泌体与传统超速离心方法相比，EGF蛋白含量更高，并且可以保持外泌体的完整性和生物学功能。
[0004]上述EGF间充质干细胞外泌体的纯化主要采用特异性分离提纯EGF间充质干细胞外泌体，在纯化的过程中主要通过梯度离心法进行提纯，采用该种方式进行提纯，效率低下，影响提纯的效率和效果。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：包括以下步骤：
[0007]S1：EGF间充质干细胞培养，获得含量为90％的EGF间充质干细胞培养液；
[0008]S2：将第4代脐带间充质干细胞培养液，进行离心，弃上清液，加10mLPBS重悬；
[0009]S3：将步骤S2中的细胞液通过Exo Quick Pre
‑
cipitation试剂盒法进行超速离心法进行提取，并通过qEV柱纯化外泌体；
[0010]S4：通过TEM检测，透射电镜下观察样本。
[0011]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S1EGF间充质干细胞培养具体为：将EGF间充质干细胞组织培养于一次性无菌培养皿中，PBS充分洗涤，用组织剪将EGF间充质干细胞组织剪为长0.5cm的小段，剔除动静脉血管，接种于T
‑
25cm2培养瓶中，加入完全培养基6mL，于37℃、体积分数为5％CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70％
‑
80％融合时，传代培养，培养至第4代。
[0012]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S2中的第4代脐带间充质干细胞培养
液具体处理为：用胰蛋白酶进行消化，细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，反复吹打为单细胞悬液。
[0013]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤S2中的离心速率为2000r/min
‑
2500r/min，步骤S2中的离心时间为3
‑
10min。
[0014]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S3中的Exo Quick Pre
‑
cipitation试剂盒法具体为：培养基以2000
×
g离心30min，转移无细胞的上层清液到一个新的离心管中加入样本量1/2的试剂，混匀，4℃过夜，以10000
×
g离心1h,弃上清，将沉淀用50uLPBS重悬后，保存至
‑
80℃待用。
[0015]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤S3中qEV柱纯化外泌体具体为：室温无菌PBS30ml平衡柱子，将超速离心后所得0.5ml细胞悬液样本过柱，同时用1.5mlEP管收集流出液，每0.5ml定义一个流分，顺序编号为F1
‑
F11；30mlPBS洗脱，收集F1
‑
F11外泌体悬液。
[0016]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述步骤S4中的TEM检测具体为：在铜网上加入收集的F1
‑
F11外泌体悬液5
‑
10μl，吸附1min，干燥1min，醋酸双氧铀室温染色1min，吸干染液，干燥过夜后，透射电镜下观察样本。
[0017]作为本专利技术的一种优选技术方案，TEM检测后还包括NTA检测，具体为：NTA检测使用经过滤的PBS1ml复匀外泌体，擦拭样品池，确保光路上无颗粒附着外管壁，适度倾斜样品池缓慢注人外泌体溶液，将样品池放入仪器，按照仪器操作规程上机检测。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0019]本专利技术一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，通过对EGF间充质干细胞的培养、并通过Exo Quick Pre
‑
cipitation试剂盒法提取，有效的提高了EGF间充质干细胞外泌体的提取效率，同时EGF间充质干细胞提纯方法采用qEV柱纯化，取代传统的密度梯度离心法，不仅降低了纯化时间，而且提高了纯化效率。
具体实施方式
[0020]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]本专利技术提供了一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法的技术方案：
[0022]包括以下步骤：
[0023]S1：EGF间充质干细胞培养，获得含量为90％的EGF间充质干细胞培养液；
[0024]S2：将第4代脐带间充质干细胞培养液，进行离心，弃上清液，加10mLPBS重悬，制备外泌体，具体的：选择生长状态良好的第4代EGF间充质干细胞60瓶((T
‑
75cm2)，用含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，待细胞融合至70％
‑
80％时换无血清培养基培养，I48
‑
72h后收集条件培养基共600mL，随后所得上清液经过0.22μm一次性滤器，收集上清。将条件培养基平均分成3份，每份200mL；
[0025]S3：将步骤S2中的细胞液通过Exo Quick Pre
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cipitation试剂盒法进行超速离心法进行提取，并通过qEV柱纯化外泌体；
[0026]qEV柱纯化外泌体具体为：室温无菌PBS30ml平衡柱子，将超速离心后所得0.5ml细
胞悬液样本过柱，同时用1.5mlEP管收集流出液，每0.5ml定义一个流分，顺序编号为F1
‑
F11；30mlPBS洗脱，收集F1
‑
F11外泌体悬液；
[0027]S4：通过TEM检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：EGF间充质干细胞培养，获得含量为90％的EGF间充质干细胞培养液；S2：将第4代脐带间充质干细胞培养液，进行离心，弃上清液，加10mLPBS重悬；S3：将步骤S2中的细胞液通过Exo Quick Pre
‑
cipitation试剂盒法进行超速离心法进行提取，并通过qEV柱纯化外泌体；S4：通过TEM检测，透射电镜下观察样本。2.根据权利要求1所述的一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于：所述步骤S1EGF间充质干细胞培养具体为：将EGF间充质干细胞组织培养于一次性无菌培养皿中，PBS充分洗涤，用组织剪将EGF间充质干细胞组织剪为长0.5cm的小段，剔除动静脉血管，接种于T
‑
25cm2培养瓶中，加入完全培养基6mL，于37℃、体积分数为5％CO2细胞培养箱中培养，当细胞达到70％
‑
80％融合时，传代培养，培养至第4代。3.根据权利要求1所述的一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于：所述步骤S2中的第4代脐带间充质干细胞培养液具体处理为：用胰蛋白酶进行消化，细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，反复吹打为单细胞悬液。4.根据权利要求1所述的一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化方法，其特征在于：步骤S2中的离心速率为2000r/min
‑
2500r/min，步骤S2中的离心时间为3
‑
10min。5.根据权利要求1所述的一种EGF间充质干细胞外泌体的纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：张扬，徐健，杨梓宸，李陶，周晓宇，
申请(专利权)人：中科宝承生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：