胎盘间充质干细胞制备的外泌体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及胎盘间充质干细胞制备的外泌体及其用途。一方面，本发明专利技术涉及使用胎盘间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，并且其表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81，该外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于65％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于75％。该外泌体制法为：将间充质干细胞接种至培养瓶中，培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL

【技术实现步骤摘要】
al.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem cell research.2010；4(3):214
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22.)。Xin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR
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133b到神经细胞，可促进神经轴突的生长(可参见：Xin H,Li Y,Buller B,Katakowski M,Zhang Y,Wang X,et al.Exosome mediated transfer of miR
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133b from multipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neurite outgrowth.Stem cells.2012；30(7):1556
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64.)。Filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体NKG2D(naturalkiller group 2,member D)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫系统(可参见：Filipazzi P,Burdek M,Villa A,Rivoltini L,Huber V.Recent advances on the role of tumor exosomes in immunosuppression and disease progression.Seminars in cancer biology.2012；22(4):342
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9)。
[0007]外泌体(exosome)这种由活细胞分泌的膜泡，最早于1983年被发现。随着研究深入，发现其具有执行蛋白、核酸的运输，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件，参与细胞间的通讯等功能，而不断受到重视。外泌体携带蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性两类蛋白分子。前者可能与外泌体的生物发生和生物学作用有关，主要包括：细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白和四跨膜蛋白；另一类是特殊蛋白质，这类蛋白质只存在于某种特殊的细胞分泌的外泌体，而这些特定细胞源的外泌体与其生物学功能有着密切联系，例如：分子来源的外泌体上含有MHCII类分子。因此，不同细胞源的外泌体所携带的信号分子不一样，发挥的功能也不尽相同。例如：肿瘤细胞分泌的外泌体能够介导血管再生肿瘤细胞增殖及免疫逃逸，而树突状细胞源性外泌体则能够引起机体有效的抗肿瘤免疫应答。已有的研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质rRNA和microRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。
[0008]外泌体作为一种纳米级的脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。外泌体天然存在于体液中、包括血液、唾液、尿液、母乳等。外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。包括肿瘤在内的几乎所有的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可以被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。宿主细胞抑或是肿瘤细胞分泌的外泌体都参与了细胞的生长、增值，代谢和调控等作用。免疫细胞和肿瘤细胞之间也可以通过外泌体进行信息交换，这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用：外泌体即可以通过抑制免疫细胞(DCs、NK细胞、CD4+、CD8+T细胞等)引发抗肿瘤反应，又可以诱导免疫抑制或调节细胞群(MDSCs、Tregs、Bregs)的免疫抑制。
[0009]目前研究发现，间充质干细胞的外泌体携带有多种有效的细胞因子、蛋白和小分子核酸物质，可有效介导细胞增殖、凋亡和功能调节作用。研究发现，外泌体中含有血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板增殖因子、肿瘤坏死因子和肿瘤生长因子等，具有抑制细胞凋亡、细胞的纤维化程度，促进血管发生有丝分裂和介导免疫反应等功能。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的外泌体携带的胰岛素样生长因子和血管内皮细胞生长因子是治疗急性肾损伤的关键主导因子。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的外泌体脂膜表面表达有多种膜蛋白，如：凝血因子、肿瘤坏死因子、MHC I/II分子以及CCR5趋
化因子受体等，这些脂膜表面蛋白对抵抗炎症具有重要的作用。
[0010]目前进行外泌体提取的方法和途径也多种多样，现有的外泌体提取方法主要采用超速离心法或昂贵的试剂盒过柱子法，然而超速离心法所获取的外泌体质量不均一、不能保证外泌体所获取量、逐级离心时间冗长，有时甚至离心时间或者离心速度原因而最终无法分离得到，浪费时间及成本。而试剂盒过柱子法通常只能适用于较小量的外泌体获取，并且成本昂贵。
[0011]现有技术已有一些关于外泌体的分离提取方法的报道。例如，CN106282107A(中国专利申请号201610779165.2)公开了一种从人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法，CN105708861A(中国专利申请号201610149852.6)公开了骨髓间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用，CN105267240A(中国专利申请号201410781765.3)公开了间充质干细胞来源的外泌体的用途，CN104382827A(中国专利申请号201410705462.3)公开了人羊膜间充质干细胞外泌体的用途，CN103767985A(中国专利申请号201210402915.6)公开了人源血液或间充质干细胞分泌外泌体的制备与应用。然而，现有技术中，采用各种来源的间充质干细胞培养上清液来提取外泌体，这些方法均存在产量偏低、工艺复杂等的不足。
[0012]因此，本领域仍然期待有新的方法来分离提取外泌体，特别是以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。此外，本领域还期待提供一种治疗炎性疾病的方法例如通过使用外泌体治疗炎性疾病的方法。

技术实现思路

[0013]本专利技术的目的在于提供一种新的方法来分离提取外泌体，特别是这种方法能够以简单易得和高产量的方式通过间充质干细胞分泌提取外泌体。已经出人意料的发现通过本专利技术方法能够有益的实现上述目的。本专利技术基于此发现而得以完成。
[0014]本专利技术涉及的间充质干细胞是胎盘来源的。
[0015]为此，本专利技术第一方面提供了一种使用胎盘间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，例如其具有75～150nm的平均粒径。
[0016]根据本专利技术第一方面的外泌体，其表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于65％，例如大于70％，例如大于75％。在一个实施方案中，外泌体膜蛋白CD81的阳性表达率大于75％，例如大于80％，例如大于85％。
[0017]根据本专利技术第一方面的外泌体，其是使用胎盘间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：
[0018本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.使用胎盘间充质干细胞分离提取的外泌体，其具有50～200nm的平均粒径，并且其表达了膜蛋白CD9和膜蛋白CD81，该外泌体膜蛋白CD9的阳性表达率大于70％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于80％。2.根据权利要求1的外泌体，其具有75～150nm的平均粒径，并且膜蛋白CD9的阳性表达率大于75％，膜蛋白CD81的阳性表达率大于85％。3.根据权利要求1的外泌体，其是使用胎盘间充质干细胞通过包括如下步骤的方法制备得到的：(1)将间充质干细胞接种至培养瓶中，添加MSC完全培养基，置37℃、5％CO2培养箱中培养使细胞贴壁，再向培养液中添加IL
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1β至浓度8～12ng/mL，继续培养；(2)吸弃培养基，更换为新鲜的MSC完全培养基，使细胞继续于37℃、5％CO2培养箱中培养直至细胞融合度≥80％；(3)吸弃培养基，用PBS清洗，然后添加MSC完全培养基，再置于37℃、2％O2、5％CO2培养箱中培养42～56小时；(4)吸取细胞上清液置离心管中，进行如下离心处理：以250～350g、4℃离心8～12分钟，吸取上清液至另一离心管中；以1500～2500g、4℃离心18～25分钟，吸取上清液至另一离心管中；以8000～12000g、4℃离心25～35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后置于另一离心管中；以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清；(5)向离心管中添加无菌PBS使外泌体沉淀重悬，以80000～120000g、4℃离心75～120分钟，弃上清液，加无菌PBS使外泌体重悬，得到呈悬液形式的外泌体。4.根据权利要求3的外泌体，步骤(1)中，间充质干细胞是P2～P8代的细胞，例如是P3～P6代的细胞；培养瓶中以(0.5～5)
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10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞，例如以(0.5～2)
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10^4个细胞/cm^2的密度添加细胞；使用T75培养瓶，每瓶接种(2～10)
×
10^5个细胞例如7.5
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10^5个细胞，添加培养基10～20ml；培养20～30小时例如培养24小时使细胞贴壁；添加IL
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1β后继续培养20～30小时例如培养24小时；在添加IL
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1β的同时还向培养液中添加酒石酸钠、赖氨酸，二者的浓度分别为0.15～0.2mg/mL、2.0～2.5mg/mL，例如二者的浓度分别为0.15mg/mL、2.2mg/mL。5.根据权利要求3的外泌体，步骤(3)中，在37℃、2％O2、5％CO2培养箱中培养48小时。6.根据权利要求3的外泌体，步骤(4)中，首先以250g、4℃离心12分钟，接着以2500g、4℃离心18分钟，接着以8000g、4℃离心35分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以120000g、4℃离心75分钟；首先以350g、4℃离心8分钟，接着以1500g、4℃离心25分钟，接着以12000g、4℃离心25分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以80000g、4℃离心120分钟；首先以300g、4℃离心10分钟，接着以2000g、4℃离心20分钟，接着以10000g、4℃离心30分钟，上清液用0.22μm滤膜过滤后以100000g、4℃离心90分钟。
7.根据权利要求3的外泌体，步骤(5)中，以100000g、4℃离心90分钟，或者以80000g、4℃离心120分钟，或者以120000g、4℃离心75分钟；所得的外泌体悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏卿，肖海蓉，刘庆喜，裴丽环，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：