一种检测心血管疾病药物反应相关基因位点的扩增引物组、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测心血管疾病药物反应相关基因位点的扩增引物组、试剂盒及检测方法。本发明专利技术基于多重PCR和高通量测序技术，可以一次性对影响药物反应的22个基因的34个变异位点进行检测，可指导降血压类、降血糖类、降血脂类、抗心功能不全类、抗凝类相关药物的安全有效的使用。本发明专利技术提高了检测效率、准确率，同时降低了检测成本、简化操作步骤，是对心血管疾病个体化精准用药的创新。疾病个体化精准用药的创新。

【技术实现步骤摘要】
一种检测心血管疾病药物反应相关基因位点的扩增引物组、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体为一种检测心血管疾病药物反应相关基因位点的扩增引物组、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]心血管疾病包括心脏疾病、脑血管疾病和血管疾病，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”的特点，是全球人群死亡的主要原因，据世界卫生组织统计，每年有近1800万人死于心血管疾病，占全球死亡总人数的30％以上。调整生活作息、控制饮食、适当运动等日常生活方式的改善是部分心血管疾病治疗的基础，药物治疗是心血管疾病治疗的主要方式，介入治疗和外科手术治疗也是心血管疾病治疗的重要手段。
[0003]目前广泛使用的心血管疾病药物有：美托洛尔、硝苯地平、氨氯地平、卡托普利、依那普利、氯沙坦、氢氯噻嗪等降血压类药物；二甲双胍、格列齐特、格列本脲等降血糖类药物；辛伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀等降血脂类药物；卡维地洛、地高辛、硝酸甘油等抗心功能不全类药物；华法林、氯吡格雷等抗凝类药物。临床药物治疗中大都根据经验用药，相同的药物，不同个体使用会出现不同的治疗效果。因此，因人而异、量体裁衣的个体化用药越来越重要。药物基因组学的发展推动着心血管疾病药物更安全有效的使用，通过对个体药物代谢酶、药物转运体或药物靶点基因多态性的检测，根据个体的基因型选择合适的心血管药物，避免药物不良反应的发生，获得最佳的治疗效果。
[0004]当前使用的基因检测方法有很多，如荧光定量PCR法、基因芯片法、一代测序法、高通量测序法等。荧光定量PCR法通量低，检测的基因位点较少。基因芯片法虽然能同时对多个基因位点进行检测，但其只可检测已知位点，灵活性低且费用高。一代测序法是基因检测的金标准，但其检测的位点较少。高通量测序法在基因检测中具有强大的功能，其通量高、准确率好。多重PCR技术可在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个目标DNA片段，可显著节省时间和试剂成本，高效、经济简便。多重PCR技术结合高通量测序可以一次性检测多个影响个体药物反应的基因位点，通量高且经济高效，可以帮助个体更安全有效的使用药物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测心血管疾病药物反应相关基因位点的多重PCR扩增引物组、试剂盒及方法，可以高效率、低成本、全面的检测相关基因是否存在突变，指导个体安全有效的使用心血管疾病药物。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术包括的多重PCR特异性扩增引物组涉及与心血管疾病药物毒副作用或有效性相关的22个基因的34个变异位点，基因及位点信息为：
[0007][0008][0009]基因位点的34对扩增引物的核酸序列如表1SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:68所示。
[0010]本专利技术还公开了一种检测与心血管疾病药物反应相关的基因位点的试剂盒，包含所述扩增引物组、PCR扩增试剂(DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液)、Index。
[0011]本专利技术检测心血管疾病药物反应相关基因位点，包括如下步骤：
[0012]S1.提取待测样本的基因组DNA，检测浓度及纯度，备用；
[0013]S2.第一轮多重PCR反应：
[0014]使用所述扩增引物组配置PCR反应体系，然后按照多重PCR反应程序进行反应；
[0015]S3.第二轮接头序列PCR
[0016]对S2所得多重PCR产物进行磁珠纯化，然后配置PCR反应体系，然后进行PCR反应进行末端修饰，与Index连接；
[0017]S4.文库质检与测序
[0018]对S3所得第二轮接头序列PCR所得产物进行磁珠纯化，然后使用Qubit进行浓度测定，记录文库浓度，然后测量文库片段长度和纯度，质检合格后进行高通量测序。
[0019]作为改进，S1步骤中所述待测样本包括：血液、咽拭子、唾液、石蜡包埋组织。
[0020]作为改进，S2步骤中所述多重PCR的反应体系为：
[0021]组分体积IGT
‑
EM808polymerasemixture10μlEnhancerbufferNB(1N)3.5μlEnhancerbufferM2.5μlPrimerpool5μlgDNA40ngddH2O补足至30μl
[0022]所述多重PCR反应程序为：95℃3min30s，1个循环；98℃20s，60℃4min，18个循环；72℃5min，1个循环。
[0023]作为改进，S3步骤中所述第二轮接头序列PCR反应体系为：
[0024]组分体积多重PCR产物13.5μlEnhancerbufferM2.5μlddH2O2μlIGT
‑
I5Index(10μM)1μlIGT
‑
I7Index(10μM)1μl
IGT
‑
EM808polymerasemixture10μl
[0025]所述第二轮接头序列PCR反应程序为：95℃3min30s，1个循环；98℃20s，58℃1min，72℃30s，9个循环；72℃5min，1个循环。
[0026]作为改进，S4所述质检合格的判断标准为：浓度处于5ng/μl
‑
50ng/μl之间，片段长度分布在280
‑
420bp之间，无杂峰。
[0027]作为改进，S4步骤中所述高通量测序平台包括IlluminaHiSeq/MiSeq/NextSeq等测序平台。
[0028]本专利技术的优点在于：
[0029]本专利技术可一次性对34个影响药物反应的基因位点进行检测，可指导降血压类、降血糖类、降血脂类、抗心功能不全类、抗凝类相关药物的安全有效的使用。本专利技术提高了检测效率、准确率，同时降低了检测成本、简化操作步骤，是对心血管疾病个体化精准用药的创新。
具体实施方式
[0030]下面通过具体实施例对本专利技术进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本专利技术，但是下述实施例并不限定本专利技术的保护范围。
[0031]实施例1
[0032]本实施例对引物进行设计和验证
[0033]引物设计使用primer3.0软件进行，引物长度在20
‑
30nt之间，引物设计退火温度在60℃左右，扩增片段长度在150
‑
300bp，得到基于多重PCR的34个基因位点的特异性引物，经过验证得到扩增特性良好的特异性引物，上述特异性引物、引物序列号、引物序列、扩增片段长度列于表1。
[0034]表1引物信息
[0035][0036][0037][0038][0039][0040]设计完毕后，使用引物组对具体基因点位进行检验并验证引物组的检测效果。
[0041]使用引物组进行检测的方法如下：
[0042]S1.提取待测样本的基因组DNA，检测浓度及纯度，备用；待测样本包括但不限于血液、咽拭子、唾液、石蜡包埋组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测心血管疾病药物反应相关基因位点的扩增引物组，其特征在于，所述相关基因及变异位点为：基因位点位置(GRCh37)变异(Ref>Alt)ABCB1rs1045642Chr7:87138645A>GABCG2rs2231142Chr4:89052323G>TACErs1799752Chr17:61565890D>IADD1rs4961Chr4:2906707G>TADRB1rs1801253Chr10:115805056G>CADRB2rs1042714Chr5:148206473G>CAGTR1rs5186Chr3:148459988A>CALDH2rs671Chr12:112241766G>AAPOErs429358Chr19:45411941T>CAPOErs7412Chr19:45412079C>TC11orf65rs11212617Chr11:108283161C>ACYP2C19rs12248560Chr10:96521657C>TCYP2C19rs4986893Chr10:96540410G>ACYP2C19rs4244285Chr10:96541616G>CCYP2C9rs1799853Chr10:96702047C>TCYP2C9rs1057910Chr10:96741053A>CCYP2D6rs1135840Chr22:42522613G>CCYP2D6rs35742686Chr22:42524243CT>CCYP2D6rs3892097Chr22:42524947C>TCYP3A5rs776746Chr7:99270539C>TCYP4F2rs2108622Chr19:15990431C>TGNB3rs5443Chr12:6954875C>TKCNJ11rs5219Chr11:17409572T>CKIF6rs20455Chr6:39325078A>GPEAR1rs12041331Chr1:156869714G>ASLCO1B1rs2306283Chr12:21329738A>GSLCO1B1rs4149056Chr12:21331549T>CVKORC1rs7294Chr16:31102321C>TVKORC1rs2359612Chr16:31103796A>GVKORC1rs8050894Chr16:31104509C>GVKORC1rs9934438Chr16:31104878G>AVKORC1rs2884737Chr16:31105554A>CVKORC1rs9923231Chr16:31107...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭建成，占闽宁，尚文俊，冯帅升，朱丹丹，王丙顺，张静，张悦，史健翔，许红恩，刘海芳，薛夏，柳丹华，秦亚平，薛滨雨，
申请(专利权)人：郑州远止生物研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：