一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达量的诱导方法技术

本发明专利技术提供了一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH

【技术实现步骤摘要】
一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30表达量的诱导方法


[0001]本专利技术涉及基因工程生物
，具体地，涉及一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30表达量的诱导方法。

技术介绍

[0002]cathelicidins是一种在先天免疫系统中发挥重要作用的阳离子宿主防御肽，眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30为cathelicidins的截短肽，由30个氨基酸序列组成，目前研究发现其对大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。
[0003]目前基因工程制备眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30诱导表达实验中发现，本重组毕赤酵母在BMGY中可以分泌表达眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30，但在BSM培养基中几乎不分泌表达，且酵母生长速度较慢。为解决这一问题，现提出一种通过添加复合成分在BSM培养基中以提高眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30表达量的诱导方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30表达量的诱导方法，该方法能够提高重组毕赤酵母的生长速度，增加其分泌表达眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30。
[0005]本专利技术的目的是通过以下方案实现的：本专利技术提供一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30表达量的诱导方法，其主要步骤如下：S01：制备诱导表达培养基，按照常规实验方法先配制YPD基础培养基,再配制BSM培养基，得到BSM培养基，所述BSM培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.186g，硫酸钾3.6g，七水硫酸镁2.98g，氢氧化钾0.826g，85%磷酸5.34ml，PTM1 4ml，氨基酸10g，余量为去离子水。
[0006]S02：对眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30进行表达实验，将含有表达质粒的毕赤酵母菌接种至S01制得的培养基中，29℃培养18小时就可进入诱导阶段，诱导阶段29℃培养24h
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48h，然后将菌液离心取上清液，过0.22μm滤膜后得到表达量提高的表达液。
[0007]优选的，所述S01步骤中BSM培养基中的氨基酸为组氨酸、苏氨酸与组氨酸组合氨基酸、亮氨酸与组氨酸组合氨基酸或苏氨酸与亮氨酸组合氨基酸。
[0008]本专利技术有益效果为：本专利技术的诱导表达方法能够明显提高毕赤酵母的生长速度，较快的进入诱导阶段，添加组氨酸的培养基提高诱导表达量2.7%左右，添加组氨酸与苏氨酸的氨基酸组合物培养基提高诱导表达量80%左右，且有明显的抑菌效果。
[0009]附图说明：图1：添加组氨酸、组氨酸与苏氨酸组合氨基酸、对照组的3种诱导48h表达液的高
效液相色谱检测图。
[0010]具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。
[0011]本专利技术提供一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30表达量的诱导方法，为眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30大规模发酵提供基础。
[0012]实施例1：添加氨基酸为组氨酸的实验（1）.试剂与材料葡萄糖购于临沂市兰山区丰源食品添加剂经营部；赖氨酸、苯丙氨酸购于广州康荻尔生物科技有限公司；二水硫酸钙、硫酸钾、胰蛋白胨、酵母浸膏、氢氧化钠、氨水、二水钼酸钠、浓硫酸、五水硫酸铜、硼酸购于国药集团；七水硫酸镁、氢氧化钾、85%磷酸、七水硫酸铁购于天津市福晨化学试剂厂；碘化钾购于西胧科学股份有限公司；六水氯化钴购于无锡市亚泰联合化工有限公司；生物素购于生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化锌购于无锡市亚泰联合化工有限公司；一水硫酸锰购于江苏强盛功能化学股份有限公司；（2）.培养基的配制方法
①
.配制YPD基础培养基：a：称取6g胰蛋白胨、3g酵母浸膏，加入270ml纯水溶解，用1M氢氧化钠溶液调整pH至7,121℃高压灭菌 20min；b：称取20g葡萄糖，加入60ml纯水溶解后定容至100ml，108℃高压灭菌 30min，得到20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液；c：在步骤1中所配制的溶液，缓慢加入30ml的20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液，得到基础培养基YPD。
[0013]②
.配制BSM培养基：a：称取20g葡萄糖、0.186g二水硫酸钙、3.6g硫酸钾、2.98g七水硫酸镁、0.826g氢氧化钾，加入800 mL去离子水溶解，加入5.34 mL 85%磷酸，定容至1000 mL，121℃高压灭菌 20min；b：称取3g组氨酸，加入300 mL步骤（1）所配制的溶液中，65℃加热使其溶解，用氨水调整pH 到5.0，过0.22μm滤膜，待用；c：配制PTM1溶液，称取6g五水硫酸铜、0.08g碘化钾、3g一水硫酸锰、0.2g二水钼酸钠、0.02g硼酸、0.5g六水氯化钴、20g氯化锌、65g七水硫酸铁、0.2g生物素、5mL浓硫酸，加入800 mL纯水溶解，定容至1000 mL，得到微量盐溶液PTM1；d：取1.2 mL PTM1 加入到步骤b所配制待用的溶液中，得到BSM培养基。
[0014]（3）眼镜王蛇抗菌肽OH
‑
CATH30的表达实验
①
眼镜王蛇抗菌肽OH
‑
CATH30的生长期扩增a：挑取含有表达质粒的毕赤酵母菌单菌落，接种于20 mLYPD培养基中，29℃，
220rpm培养16h，制得一级种子液；b：按1%的比例将一级种子液接种于100 mL YPD培养基中，29℃，220rpm扩大培养16h，制得二级种子液；c：按10%的比例将二级种子液接种于300mL实施例2中配制的BSM培养基中，29℃，220rpm培养66h。结果见表1。
[0015]②
眼镜王蛇抗菌肽OH
‑
CATH30的诱导期表达a：将上述添加氨基酸的培养基分别添加甲醇、山梨醇，对重组酵母开始诱导表达。
[0016]③
进行抑菌实验a：收集48h表达液，过0.22μm滤膜去除大分子后做金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）2种病原菌的平板抑菌实验，37℃培养约16h后取出观察抑菌圈的大小。结果见表2。
[0017]实施例2：添加氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高眼镜王蛇抗菌肽OH
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CATH30表达量的诱导方法，其特征在于：所述诱导方法步骤为：S01：制备诱导表达培养基，按照常规实验方法配制YPD基础培养基,再配制BSM培养基，得到诱导表达BSM培养基；所述BSM培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.186g，硫酸钾3.6g，七水硫酸镁2.98g，氢氧化钾0.826g，85%磷酸5.34ml，PTM1 4ml，氨基酸10g，余量为去离子水；S02：对眼镜王蛇抗菌肽OH
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【专利技术属性】
技术研发人员：卢玉平，朱新鹏，沈李元，李雯倩，钱晓明，
申请(专利权)人：江苏亢钧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：