一种灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法。该方法至少包括以下步骤：(1)取待测样品液于试管中，并在试管中加入细胞裂解液，并将所得物在50

【技术实现步骤摘要】
一种灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法


[0001]本专利技术属于分类号为C12Q1/689的
，具体涉及一种灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法。

技术介绍

[0002]支原体是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3微米。支原体广泛存在于人和动物体内，支原体可通过黏附作用与宿主细胞结合，从细胞膜获取脂质和胆固醇，使细胞膜损伤。
[0003]专利申请号为CN202010576699.1的专利中公开了一种支原体的通用PCR检测方法及其检测试剂盒，该试剂盒通过选取了16SrRNA序列中的V6高变区和V9高变区序列作为支原体特异性通用引物设计区域，多处引入兼并碱基，设计并筛选遗传基因序列作为支原体的通用PCR检测引物，并进行支原体的检测。但是该试剂盒使用时需要做PCR产物的电泳检测，操作过程极其繁琐而且灵敏度和适用性较低。本技术方案中提供了一种采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(QPCR)检测样品中的支原体侵染情况的方法，通过在待测样品的中的DNA扩增反应中引入荧光物质，使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，通过荧光信号的检测从而反应PCR产物的含量，从而实现对待测样品中支原体侵染情况的检测。该方法无需及进行电泳操作，具有较短的检测周期和较高的检测效率，且由于进行了DNA扩增，大幅度提高了检测的灵敏度。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术的第一个方面提供了一种灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法，至少包括以下步骤：
[0005](1)取待测样品液于试管中，并在试管中加入细胞裂解液，并将所得物在50
‑
80℃的条件下，进行加热3
‑
15min；
[0006](2)在步骤(1)中的所得物中加入DNA析出液，将所得物转移至吸附柱内并在8000
‑
12000r/min的条件下进行离心；
[0007](3)使用洗涤液对步骤(2)中的所得物进行洗涤，并在10000
‑
12000r/min的条件下进行离心，离心后弃去废液；
[0008](4)配制待测样品组的聚合酶链式反应(PCR)待测品、阳性对照组的聚合酶链式反应待测品和阴性对照组的聚合酶链式反应待测品，并根据实时荧光聚合酶链式反应定量法分别对待测样品组、阳性对照组和阴性对照组进行荧光测试，并根据判断标准判断各组样品的支原体侵染情况。
[0009]专利技术人在配制待测样品组、阳性对照组和阴性对照组时，加入实时定量PCR法测试所需要的特异引物、荧光物质以及DNA聚合酶。
[0010]作为一种优选的技术方案，所述步骤(1)中的具体步骤为：取待测样品液100
‑
300μl至第一EP管中，向第一EP管中加入DNA裂解液，并将所得物在50
‑
80℃的条件下，进行加热
3
‑
15min，加热期间颠倒混匀4次，所述DNA裂解液为购自赛多利斯试剂盒Microsart AMP Extraction试剂中的Buffer A1。
[0011]作为一种优选的技术方案，所述步骤(2)中的具体步骤为：在步骤(1)的所得物中加入DNA析出液，之后转移至吸附柱内10000
‑
20000r/min并离心，之后弃去废液，所述DNA析出液购自赛多利斯试剂盒Microsart AMP Extraction试剂中的Buffer A2。
[0012]作为一种优选的技术方案，所述步骤(2)中的离心时间在0.1
‑
2min。
[0013]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)中通过内参法对待测样品组的聚合酶链式反应待测品、阳性对照组的聚合酶链式反应待测品和阴性对照组的聚合酶链式反应待测品进行荧光测试。
[0014]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)中实时荧光定量PCR法所用的荧光物质为荧光探针。
[0015]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光定量PCR法进行检测时的扩增循环数在40
‑
45Cycles。
[0016]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光定量PCR法进行检测时的扩增循环数在43Cycles。
[0017]荧光探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩展时活性酶会将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，从而实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步，通过荧光检测可以反映出支原体的DNA扩增的数量。扩增循环次数越高，支原体的DNA扩增量越多，检测的灵敏度越好。但是专利技术人发现当支原体的DNA扩增量较多时，检测结果不稳定，专利技术人认为可能的原因是扩增循环次数较多时，扩增反应中的DNA聚合酶的浓度会偏低，导致扩增产物不均衡，进而导致扩增结果不稳定，在测试过程中容易受到外部物质的干扰，反而降低了检测的可操作性。专利技术人意外发现当扩增循环次数为43时，检测结果不仅具有较高的灵敏度和适用性，而且具有较好的稳定性。
[0018]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光聚合酶链式反应定量法进行检测时的预变性温度在90
‑
95℃，预变性时间在1
‑
5min。
[0019]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光聚合酶链式反应定量法进行检测时的变性温度在90
‑
95℃，变性时间在20
‑
40s。
[0020]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光聚合酶链式反应定量法进行检测时的退火温度在50
‑
60℃，退火时间在20
‑
40s。
[0021]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光聚合酶链式反应定量法进行检测时的退火温度在53
‑
55℃，退火时间在20
‑
40s。
[0022]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光聚合酶链式反应定量法进行检测时的退火温度为53℃，退火时间为40s。
[0023]在模板经过变性阶段后，将变性温度冷却至退火温度，使特异引物与模板发生结合。但是退火温度要足够低才能满足特异引物与模板之间发生结合，但是退火温度也要足够高，才能够减少扩增过程中的非特异性结合。专利技术人发现当退火温度为53℃,退火时间为40s时，既能够使特异引物与模板之间最大限度的相结合，提高检测过程的灵敏度，又能减
少扩增中的非特异性结合，提高检测过程的稳定性。
[0024]作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)根据实时荧光聚合酶链式反应定量法进行检测时的延伸温度在58
‑
63℃，延伸时间在4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：(1)取待测样品液于试管中，并在试管中加入细胞裂解液，并将所得物在50
‑
80℃的条件下，进行加热3
‑
15min；(2)在步骤(1)中的所得物中加入DNA析出液，将所得物转移至吸附柱内并在8000
‑
12000r/min的条件下进行离心；(3)使用洗涤液对步骤(2)中的所得物进行洗涤，并在10000
‑
12000r/min的条件下进行离心，离心后弃去废液；(4)配制待测样品组的聚合酶链式反应待测品、阳性对照组的聚合酶链式反应待测品和阴性对照组的聚合酶链式反应待测品，并根据实时荧光聚合酶链式反应定量法分别对待测样品组、阳性对照组和阴性对照组进行荧光测试，并根据判断标准判断各组样品的支原体侵染情况。2.根据权利要求1所述的，灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的离心时间在0.1
‑
2min。3.根据权利要求1所述的，灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中通过内参法对待测样品组的聚合酶链式反应待测品、阳性对照组的聚合酶链式反应待测品和阴性对照组的聚合酶链式反应待测品进行荧光测试。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的，灵敏度高、适用性好的支原体侵染的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中实时荧光聚合酶链式反应定量法所用的荧光物质为荧光探针。5.根据权利要求1所述的，灵敏度高、适用性好...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，
申请(专利权)人：上海时茵昔生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：