一种刺激隐核虫的培养方法技术

本发明专利技术旨在解决鱼类刺激隐核虫无法体外培养、宿主传代培养方式成本较高的问题，提供了一种鱼类刺激隐核虫宿主传代培养和体外培养相结合的方式，不仅一定程度上实现了鱼类刺激隐核虫的体外培养，而且降低了刺激隐核虫的培养成本，培养出的刺激隐核虫毒力稳定，可用于刺激隐核虫的其它研究。本发明专利技术采用鱼体培养一代、体外培养两代交替培养的方式，解决了以往传代完全依靠鱼体培养的问题，降低了培养成本，大大方便了鱼类刺激隐核虫病的相关研究。大大方便了鱼类刺激隐核虫病的相关研究。

【技术实现步骤摘要】
一种刺激隐核虫的培养方法


[0001]本专利技术属于鱼类寄生虫培养领域，具体涉及一种刺激隐核虫的培养方法。

技术介绍

[0002]刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种原生纤毛虫，主要寄生于海水硬骨鱼类的皮肤、鳃和鳍条等部位，大量感染时常引起海水养殖鱼类严重死亡，造成重大经济损失(Colorni，1987；Dickerson，1995；李言伟等，2019)。近年来，由于我国海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成重大经济损失。
[0003]刺激隐核虫的生活史主要包括三个阶段。1、滋养体：幼虫感染宿主后寄生于宿主身上，以其组织碎片、体液以及细胞为食进行生长发育的特定时期，能在鱼体上皮内做旋转运动，呈圆形或者椭圆形。体表附着着均匀的纤毛，大小为300μm至450μm，与包囊大小差不多。由于虫体内充满着泡状物，导致虫体的透明度十分低，因此在显微镜下很难分清楚其大核与小核。从感染严重的鱼体表皮挑落下来的滋养体能够在水体中缓慢地运动，一旦碰到平皿的边缘或者底部便慢慢地停止运动。在26℃下，幼虫一般需要经过72h后才会成熟然后自然脱离宿主进入下一个时期。2、包囊：包囊有着很强的粘附性，它们会夹杂着一些碎物聚集在一起。它是刺激隐核虫生活史历时最长的一个时期，一般为数天。大小约为300
‑
500μm，呈圆形或者椭圆形。这个时期最大的特点就是纤毛退化，开始形成一个透明的囊壁，包囊壁是多层结构，随着时间延长，壁会慢慢变厚，表面会出现比较毛糙的结构。3、幼虫：幼虫的形态与其他3个阶段的虫体存在着显著的差异。幼虫的形态如瓜子型，一头小而尖、一头大，大小在50μm左右。体表同样布满了纤毛，在纤毛的摆动下，幼虫游动速度极快，与滋养体相比，透明度要高很多。虫体的柔韧性很强，在显微镜下观察能见其虫体变形现象。大多数的幼虫在水体中存活的时间不会超过24h。
[0004]刺激隐核虫的幼虫需要感染宿主，在其体表寄生，通过摄取组织碎片、细胞、体液等营养物质，才能生长发育，成熟后脱离宿主进入水体，运动一段时间后，然后形成包囊。所谓体外培养就是不借助中间宿主鱼的帮助，仅仅依靠培养基在体外完成刺激隐核虫整个生活史的一种培养方法，刺激隐核虫体外培养技术是对刺激隐核虫基础研究的一种有效手段，同时还可以对刺激隐核虫的结构、生活史、生理生化一些过程做深入研究并提供评估指标，也可以提供抗虫、杀虫药物筛选的试验模型，获得相关代谢数据，进行深入的药理学研究。而寻找合适的培养基与培养条件是体外培养刺激隐核虫最为关键的步骤。寄生虫的体外培养一直是寄生虫研究工作中的一个难点，有一部分学者认为在体外是无法完成整个寄生虫生活史的培养，其理由是寄生虫需要寄生在活的鱼体身上，通过摄取活的组织、细胞等来维持自身的生长与发育，而另外一部分学者认为可以通过模拟鱼体的体表环境，利用合适的培养基在体外完成整个寄生虫的生活史。2007年日本学者Yoshinaga报道了刺激隐核虫的体外培养外，该学者运用了双层培养基的方法，用活的细胞给刺激隐核虫幼虫提供营养物质，不管是在实验的设计与操作的难度上，都不太适合做刺激隐核虫体外培养的推广。
2013年集美大学的邹峰完成了刺激隐核虫幼虫到滋养体阶段的体外培养，但是其三种实验方案最终得到的都只是刺激隐核虫的滋养体，而且是不成熟的滋养体，最后的滋养体没能进一步发育成包囊。而刺激隐核虫的宿主传代培养方式对宿主的伤害较大，需要定期更换新的宿主，培养成本较高。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在解决鱼类刺激隐核虫无法体外培养、宿主传代培养方式成本较高的问题，提供了一种鱼类刺激隐核虫宿主传代培养和体外培养相结合的方式，不仅一定程度上实现了鱼类刺激隐核虫的体外培养，而且降低了刺激隐核虫的培养成本，培养出的刺激隐核虫毒力稳定，可用于刺激隐核虫的其它研究。
[0006]本专利技术首创性的采用刺激隐核虫鱼体培养和体外培养相结合的方式，完成了刺激隐核虫的生活史。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0008]一种刺激隐核虫的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0009](1)刺激隐核虫的鱼体培养
[0010]宿主鱼采用卵形鲳鲹，养殖容器为收集桶，该收集桶整体呈倒圆锥台形，收集桶上端开口，收集桶底部密封连接一个可移动的收集杯，收集桶的最大容量为200L，收集桶内设有进水管和排水管，收集桶内的水为循环水；向收集桶内引入约150L盐度为27
‑
29
‰
的海水，放入约20条20cm
‑
25cm的卵形鲳鲹，水温为26
‑
27℃；晚上22：00左右时，用脱包1小时内的刺激隐核虫幼虫在黑暗条件下感染卵形鲳鲹，感染剂量为每尾鱼10000个幼虫，感染方式为将脱包的刺激隐核虫幼虫溶液缓慢均匀地倒入收集桶内；3天后，用密封塞将收集桶的底部密封，移走收集杯，收集收集杯内的刺激隐核虫包囊，置于20℃条件下备用，然后将收集杯重新密封安装在收集桶底部，移走密封塞。
[0011](2)刺激隐核虫的体外培养
[0012]收集的刺激隐核虫包囊置于20℃条件下6h后，将包囊置于含有刺激隐核虫体外培养液的烧瓶中，每升培养液放2000左右个包囊，1L培养液包含：500mL胎牛血清、200mL斜带石斑鱼肌肉组织匀浆液、50mL斜带石斑鱼体表粘液、0.01mL福尔马林、8g葡萄糖、5g鱼鳞粉、700mg D
‑
半乳糖、200mg L
‑
谷氨酰胺、500mg丙酮酸钠，余量为灭菌海水：在培养液中浸入一个鱼头模型，该鱼头模型由树脂材料做成；培养条件为20℃，培养6
‑
7天后，包囊经历了幼虫和滋养体阶段，在烧瓶底部重新形成了包囊；此时倒掉培养液，收集瓶底的包囊，并将收集的包囊再次置于新的含有刺激隐核虫体外培养液的烧瓶中，还是每升培养液放2000左右个包囊，再在20℃条件下培养6
‑
7天后，倒掉培养液，收集瓶底的包囊，置于22℃灭菌海水中；3
‑
4天后，包囊释放出幼虫，用脱包1小时内的幼虫感染步骤一中的卵形鲳鲹，进行步骤(1)，如此循环。
[0013]本专利技术的优点和效果：首次通过刺激隐核虫鱼体培养和体外培养相结合的方式，完成了刺激隐核虫的传代，解决了以往传代完全依靠鱼体培养的问题，降低了培养成本，大大方便了鱼类刺激隐核虫病的相关研究。
[0014]本专利技术的刺激隐核虫体外培养液配方经过大量的筛选试验，选取了最有利于虫体存活的斜带石斑鱼肌肉组织匀浆液和体表粘液，同时还选取了低剂量福尔马林、葡萄糖和
鱼鳞粉，以上三种成分在刺激隐核虫的体外培养过程中发挥了重要作用。低剂量的福尔马林不仅提高了包囊数量，还增强了幼虫的活力。少量的葡萄糖和鱼鳞粉也十分有利于刺激隐核虫的培养。培养液中的D
‑
半乳糖、L
‑
谷氨酰胺以及丙酮酸钠，能够相互协同作用，增强了刺激隐核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种刺激隐核虫的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)刺激隐核虫的鱼体培养宿主鱼采用卵形鲳鲹，养殖容器为收集桶，该收集桶整体呈倒圆锥台形，收集桶上端开口，收集桶底部密封连接一个可移动的收集杯，收集桶的最大容量为200L，收集桶内设有进水管和排水管，收集桶内的水为循环水；向收集桶内引入约150L盐度为27
‑
29
‰
的海水，放入约20条20cm
‑
25cm的卵形鲳鲹，水温为26
‑
27℃；晚上22：00左右时，用脱包1小时内的刺激隐核虫幼虫在黑暗条件下感染卵形鲳鲹，感染剂量为每尾鱼10000个幼虫，感染方式为将脱包的刺激隐核虫幼虫溶液缓慢均匀地倒入收集桶内；3天后，用密封塞将收集桶的底部密封，移走收集杯，收集收集杯内的刺激隐核虫包囊，置于20℃条件下备用，然后将收集杯重新密封安装在收集桶底部，移走密封塞。(2)刺激隐核虫的体外培养收集的刺激隐核虫包囊置于20℃条件下6h后，将包囊置...

【专利技术属性】
技术研发人员：白立云，孙文朋，
申请(专利权)人：孙文朋，
类型：发明
国别省市：