无动物源性细胞膜片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种无动物源性细胞膜片例如间充质干细胞膜片及其制备方法。本发明专利技术还提供了该无动物源性细胞膜片例如间充质干细胞膜片在受损组织的损伤修复中的用途。膜片在受损组织的损伤修复中的用途。

【技术实现步骤摘要】
无动物源性细胞膜片及其制备方法和应用
专利

[0001]本专利技术涉及组织工程学与再生医学领域，尤其涉及无动物源性细胞膜片及其制备方法和应用。
技术背景
[0002]与以往的涉及干细胞悬液注射细胞的移植方法相比，细胞膜片是一种更高效的干细胞移植方式。细胞膜片能够有效地避免干细胞在移植过程中的流失，提高干细胞移植效率。此外，细胞膜片在制备过程中不使用酶及类似物进行细胞消化，这有效地避免了酶消化所带来的细胞外基质的破坏和细胞功能减低，细胞膜片移植能使干细胞在体内更好的发挥其功能。
[0003]间充质干细胞膜片制备过程通常涉及将传代培养的间充质干细胞用生物酶消化成单细胞，之后经过清洗以除去间充质干细胞培养基的残留，然后用成膜培养基将细胞重悬后，接种在事先包被好的温度敏感培养皿中。在37℃的培养条件下，细胞在培养皿中贴壁生长，增殖汇合。培养结束后降低培养温度，细胞呈片状自动从温敏表面脱离，即可收获细胞膜片。
[0004]细胞膜片是单层或者多层细胞组成的片状结构。间充质干细胞膜片制备过程中使用的成膜培养基和包被在温度敏感培养皿中的基质残留在细胞间隙及表面，通过外力不易被完全清洗掉。目前已经报道的膜片制备方法中使用的成膜培养基分为三类：含血清培养基、市售无血清培养基和自配无血清培养基。含血清培养基中的牛血清含有异源大分子致敏成分牛血清白蛋白，对于临床用途不够安全。市面上的间充质干细胞无血清培养基和文献中的自配间充质干细胞无血清培养基为了支持细胞生长，都含有多种外源生长因子，而外源生长因子的残留也会有安全风险。/>[0005]此外，目前膜片制备过程中包被基质为纤连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)等科研级别试剂，这些试剂在生产过程中不符合GMP标准。
[0006]因此，亟需开发一种使用更安全的成膜培养基和/或更安全的包被基质的制备间充质干细胞膜片的方法，从而获得安全性更高的间充质干细胞膜片。

技术实现思路

[0007]为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种间充质干细胞膜片产品的生产方法。该方法使用的成膜培养基成分简单，包括基础培养基和人血清白蛋白(例如药用级别)，其中不含任何动物源性成分和外源生长因子。此外，在细胞膜片制备过程中，可以使用人纤维蛋白原作为包被基质。
[0008]通过本专利技术的上述方法制备的间充质干细胞膜片产品更安全，不含有动物源性成分和外源生长因子残留(例如牛血清白蛋白残留量符合药物标准)，成膜过程所用培养基配方简单。此外，本专利技术的间充质干细胞膜片产品分泌高水平的促血管生成因子和抗炎因子，抑制淋巴细胞增殖和炎性因子分泌，能够在临床上用于多种疾病，包括自身免疫系统疾病、
器官损伤类疾病，器官移植过程中的排异反应和GVHD等。
[0009]相应的，本专利技术涉及以下方面。
[0010]在第一个方面，本专利技术涉及一种制备细胞膜片的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]a.培养和传代细胞；
[0012]b.将所述细胞转移到用基质包被的温敏培养皿中，在成膜培养基中培养，从而在培养皿中形成膜片，其中所述成膜培养基包含基础培养基和人血清白蛋白且不包含动物源性成分(例如牛血清白蛋白等)和外源生长因子；和
[0013]c.通过降低温度使细胞从所述温敏培养皿脱离。
[0014]在一些实施方案中，所述细胞膜片是干细胞膜片，例如间充质干细胞膜片。
[0015]在一些实施方案中，所述基质为纤连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(laminin)、明胶、胶原、玻连蛋白或人纤维蛋白原。用以上基质包被温敏培养皿使得间充质干细胞能够附着于所述培养皿。
[0016]在优选的实施方案中，所述基质为人纤维蛋白原。在一些实施方案中，所述人纤维蛋白原的浓度为0.1
‑
10mg/mL，例如0.2
‑
5mg/mL，例如1
‑
2.5mg/mL。
[0017]在一些实施方案中，在步骤b中，成膜培养基中的基础培养基可以选自DMEM(高糖)、DMEM(低糖)、RPMI1640、α
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MEM、DMEM/F12和F12。在一个优选的实施方案中，成膜培养基中的基础培养基为α
‑
MEM。
[0018]在一些实施方案中，在步骤b中，成膜培养基中的人血清白蛋白的浓度为0.5
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10％，优选0.5
‑
5％，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。
[0019]在一些实施方案中，在步骤b中，成膜培养基还包含非必需氨基酸(甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
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天冬氨酸、L
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天门冬酰胺、L
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谷氨酸、L
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脯氨酸、L
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丝氨酸)和/或L
‑
谷氨酰胺。
[0020]在一些实施方案中，在步骤b中使用的成膜培养基中的L
‑
谷氨酰胺的浓度为0.5mM至4mM，优选为约2mM。
[0021]在一些实施方案中，在步骤b中使用的成膜培养基中的非必需氨基酸甘氨酸、L
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丙氨酸、L
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天冬氨酸、L
‑
天门冬酰胺、L
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谷氨酸、L
‑
脯氨酸和L
‑
丝氨酸各自的浓度为50μM至200μM，优选为约100μM。
[0022]在一些实施方案中，在步骤a中，用含血清培养基(例如含有胎牛血清的培养基)培养和传代所述间充质干细胞。
[0023]在一些实施方案中，在步骤a中，用无血清培养基培养和传代所述间充质干细胞。在一些实施方案中，所述无血清培养体系包括使用选自以下的基础培养基：RPMI1640、DMEM、α
‑
MEM、DMEM/F12和F12无血清培养基，并且所述培养基补充有选自以下的一种或多种添加剂：维生素C、硒酸钠、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白(植物表达)、孕酮、腐胺、生物素、丙酮酸钠、乙醇胺、肉毒碱、氨基酸、维生素、谷胱甘肽、亚油酸和亚麻酸。
[0024]在另一些实施方案中，所述无血清培养体系包括使用选自以下的商业化培养基：CTS
TM
Stem Pro
TM
MSC SFM、MesenCult
TM
‑
ACF培养基、MesenCult
TM
‑
ACF Plus培养基和MesenCult
TM
‑
XF培养基。
[0025]在一些实施方案中，所述方法在步骤a之后步骤b之前还包括对细胞进行清洗的步骤。
[0026]在上述方法的一些实施方案中，所述间充质干细胞可以来源于选自以下的组织：
羊水、羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛、蜕膜、胎盘、脐带血、脐带、成人骨髓、成人外周血和成人脂肪组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备细胞膜片的方法，所述方法包括以下步骤：a.培养和传代细胞；b.将所述细胞转移到用基质包被的温敏培养皿中，在成膜培养基中培养从而在培养皿中形成膜片，其中所述成膜培养基包含基础培养基和人血清白蛋白且不包含动物源性成分和外源生长因子；和c.通过降低温度使细胞从所述温敏培养皿脱离。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞膜片是干细胞膜片，例如间充质干细胞膜片。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基质选自纤连蛋白、层粘连蛋白、明胶、胶原、玻连蛋白和人纤维蛋白原。4.根据权利要求3所述的方法，所述人纤维蛋白原的浓度为0.1
‑
10mg/mL，例如0.2
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5mg/mL，例如1
‑
2.5mg/mL。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中在步骤b中，成膜培养基中的基础培养基选自DMEM(高糖)、DMEM(低糖)、RPMI1640、α
‑
MEM、DMEM/F12和F12，优选为α
‑
MEM。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中在步骤b中，成膜培养基中的人血清白蛋白的浓度为0.5
‑
10％，例如0.5
‑
5％。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中在步骤b中，成膜培养基还包含：(1)甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
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天冬氨酸、L
‑
天门冬酰胺、L
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谷氨酸、L
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脯氨酸和L
‑
丝氨酸，和/或(2)L
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谷氨酰胺。8.根据权利要求7所述的方法，其中L
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谷氨酰胺的浓度为0.5mM至4mM，优选为2mM。9.根据权利要求7所述的方法，其中甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L
‑
天冬氨酸、L
‑
天门冬酰胺、L
‑
谷氨酸、L
‑
脯氨酸和L
‑
丝氨酸各自的浓度为50μM至200μM，优选为100μM。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中在步骤a中用于培养和传代的培养基为有血清培养基或补充有一种或多种外源生长因子的无血清培养基。11.根据权利要求10所述的方法，所述无血清培养基选自：RPMI1640、DMEM、α
‑
MEM、DMEM/F12和F12无血清培养基，并且所述外源生长因子选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：常德华，王娟，靳新，高爽，刘东华，刘帅，
申请(专利权)人：京东方科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：