一种心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法技术

本发明专利技术提供一种心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法。所述心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法包括如下步骤：步骤一：血清或者血浆的分离：(1)全血：通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液；(2)血浆：经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体；(3)血清：不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，在进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。本发明专利技术提供的心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法具有提高了制备效率和效果，鉴定较为准确的优点。鉴定较为准确的优点。鉴定较为准确的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法


[0001]本专利技术涉及心肌细胞外泌体的制备与鉴定
，尤其涉及一种心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法。

技术介绍

[0002]外泌体曾经被认为是细胞卸载废物的一种方式，在过去的十年中，我们对外泌体的看法发生了巨大变化。我们已经开始认识到，外泌体是从细胞中释放出来的，通过其RNA，蛋白质，脂质和DNA的载体充当信号载体和组织重塑者，参与癌症，炎症，免疫，中枢神经系统功能，心脏细胞功能。
[0003]外泌体在这些基本生物过程中的作用，它们作为生物标志物，也可作为靶向递送生物分子药物载体(如治疗)的工具研究，获取和研究外泌体所需的一切，从分离和鉴定分析以及染色等。
[0004]目前的制备方法主要包括超速离心法、沉淀法、免疫亲和捕捉法和试剂盒方式，综上几种方法通常则一使用，使用效果较差。
[0005]因此，有必要提供一种新的心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法解决上述技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术解决的技术问题是提供一种具有提高了制备效率和效果，鉴定较为准确的心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供的心肌细胞外泌体的制备包括如下步骤：
[0008]步骤一：血清或者血浆的分离：
[0009](1)全血：通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液；
[0010](2)血浆：经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体；
[0011](3)血清：不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，在进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体；
[0012]步骤二：将采集的血清收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝；此后，将其以2000
×
g离心持续10分钟获得血清；接着将血清以3000
×
g离心10分钟；将上清液以无菌PBS以1:1的比例稀释并离心再次以10000
×
g保持30分钟，然后以200000
×
g进行2小时超速离心；将颗粒在大量大量PBS中洗涤，通过0.2
‑
μm注射器过滤器过滤，并以200000
×
g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基；
[0013]步骤三：细胞培养上清：即在4℃下，首先采用300
×
g离心10min，吸取上清液，然后采用2000
×
g离心10min；吸取上清液后，采用10000
×
g高速离心30min，吸取上清液；采用140000
×
g超速离心90min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。
[0014]优选的，所述步骤三中，将得到外泌体用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140000
×
g
再次离心90min，100μL的PBS缓冲液重悬沉淀，冻存于
‑
80℃备用。
[0015]优选的，所述步骤一中，采集的血清或者血浆采用小鼠、人血、细胞培养上清、尿液、乳液、腹水、羊水、唾液等。
[0016]本专利技术还提出一种心肌细胞外泌体的鉴定方法，包括如下方法：
[0017]NTA粒径分析、电镜扫描和Western Blot；
[0018]WB(Western Blot)中的常见指标有CD9,CD63,CD81、TSG101。
[0019]优选的，外泌体形成和释放后，会形成自身特有的标志性蛋白，利用Western Blot对这些标志蛋白进行检测，可以对外泌体进行鉴定。
[0020]优选的，所述鉴定采用翌圣外泌体鉴定试剂盒，针对外泌体标志蛋白CD63和TSG101开发，适用于人、大鼠、小鼠外泌体的鉴定。
[0021]优选的，所述Western Blot实验方法：
[0022]SDS
‑
PAGE胶：10％分离胶；
[0023]样品上样量：10μg；
[0024]一抗：Anti
‑
CD63抗体，1:2000稀释；Anti
‑
TSG101抗体，1:1000稀释；4℃孵育过夜；
[0025]二抗：Anti
‑
mouse IgG，arigo ARG65350，1:10000稀释，室温孵育50min；
[0026]曝光时间：5s。
[0027]与相关技术相比较，本专利技术提供的心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法具有如下有益效果：
[0028]本专利技术提供一种心肌细胞外泌体的制备与鉴定方法：
[0029]通过多渠道得到血清或者血浆，能够降低成本，提高原料量，在操作上也较为简单，使用稳定，通过多次离心，将形成的培养基用于PBS，使用效果好，稳定性强，通过多次离心，吸取上清液，能够得到较好的外泌体，提高质量，通过将外泌体用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬，在保存时稳定，通过多渠道的方式，能够扩大试验面。
附图说明
[0030]图1为本专利技术提供的整体步骤结构示意图；
[0031]图2为一抗试验示意图。
具体实施方式
[0032]下面结合附图和实施方式对本专利技术作进一步说明。
[0033]请结合参阅图1
‑
图2，其中，图1为本专利技术提供的整体步骤结构示意图；图2为一抗试验示意图。心肌细胞外泌体的制备包括如下步骤：
[0034]步骤一：血清或者血浆的分离：
[0035](1)全血：通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液；
[0036](2)血浆：经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体；
[0037](3)血清：不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，在进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体；
[0038]通过多渠道得到血清或者血浆，能够降低成本，提高原料量，在操作上也较为简单，使用稳定；
[0039]步骤二：将采集的血清收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝；此后，将其以2000
×
g离心持续10分钟获得血清；接着将血清以3000
×
g离心10分钟；将上清液以无菌PBS以1:1的比例稀释并离心再次以10000
×
g保持30分钟，然后以200000
×
g进行2小时超速离心；将颗粒在大量大量PBS中洗涤，通过0.2
‑
μm注射器过滤器过滤，并以200000
×
g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基；
[0040]通过多次离心，将形成的培养基用于PBS，使用效果好，稳定性强；
[0041]步骤三：细胞培养上清：即在4℃下，首先采用300
×
g离心10min，吸取上清液，然后采用2000
×
g离心10min；吸取上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种心肌细胞外泌体的制备，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：血清或者血浆的分离：(1)全血：通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液；(2)血浆：经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体；(3)血清：不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，在进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体；步骤二：将采集的血清收集在1.5mL管中，并使其在37℃下凝结1小时而不进行抗凝；此后，将其以2000
×
g离心持续10分钟获得血清；接着将血清以3000
×
g离心10分钟；将上清液以无菌PBS以1:1的比例稀释并离心再次以10000
×
g保持30分钟，然后以200000
×
g进行2小时超速离心；将颗粒在大量大量PBS中洗涤，通过0.2
‑
μm注射器过滤器过滤，并以200000
×
g离心1小时，然后收集沉淀并重悬于PBS或PBS中用于后期功能或生化测定的培养基；步骤三：细胞培养上清：即在4℃下，首先采用300
×
g离心10min，吸取上清液，然后采用2000
×
g离心10min；吸取上清液后，采用10000
×
g高速离心30min，吸取上清液；采用140000
×
g超速离心90min；除去上清液，所获得的沉淀即为外泌体。2.根据权利要求1所述的心肌细胞外泌体的制备，其特征在于，所述步骤三中，将得到外泌体用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后，140000...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾政，邢正江，刘茜，解英，李春城，
申请(专利权)人：昆明市延安医院，
类型：发明
国别省市：