一种用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法及用途。该方法是将功能单体、交联剂、引发剂、表面活性剂配成混合反应液，除氧后搅拌反应合成聚合物颗粒，透析得到用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体。本发明专利技术制备的载体通过选择性靶向识别His标签多肽可从发酵液等复杂样品中一步分离纯化和固定化含His标签的酶和蛋白质。该载体具有pH敏感性能，在中性pH选择性地捕获含His标签的酶和蛋白质，而在弱碱性pH相互作用大大减弱，从而可在温和条件下释放含His标签的酶和蛋白质，实现含His标签的酶和蛋白质的一步分离纯化与固定化，同时实现载体的再生利用。同时实现载体的再生利用。同时实现载体的再生利用。

【技术实现步骤摘要】
一种用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法及用途


[0001]本专利技术属于生物分离与生物催化
，具体涉及了一种用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法及用途。

技术介绍

[0002]重组蛋白在现代生物科学和生物技术中占有重要地位，从酶工程的技术应用到人类疾病的新疗法。为了满足这些不断扩大的需求，现在使用多种表达系统生产重组蛋白。无论表达系统如何，重组蛋白的生产和纯化都是密切相关的。
[0003]在重组蛋白的N端或C端融合亲和标签已广泛用于简化纯化、提高蛋白质产量、防止蛋白水解、促进蛋白质重折叠、降低/增加抗原性或增加溶解度，His标签的价值部分源于它们的小尺寸，标签的存在对蛋白质表达和折叠几乎没有破坏性影响。His标签与许多蛋白质广泛相容，并且通常由可酶切基团进行去除。然而，产物蛋白的物理性质和稳定性往往限制了分离纯化的条件。缺乏“一刀切”的解决方案继续推动分离和纯化。
[0004]附加到蛋白质N或C末端的组氨酸标签是最常用的亲和标签之一，通常六个组氨酸残基(His6)的存在，允许多个咪唑基团与固定在固相载体上的四齿配体次氮基三乙酸(NTA)的过渡金属离子(例如Ni
2+
、Co
2+
、Cu
2+
、Zn
2+
)配位。该系统即金属离子固定化亲和色谱(IMAC)，已被证明非常适用于亲和纯化。然而，IMAC并非没有缺点。富含组氨酸的蛋白质可以与色谱柱上的固定金属配合，并与目标蛋白质共洗脱。由于金属去除或与柱上金属交换的潜在风险，在IMAC柱上纯化金属蛋白时也会出现问题。通过使用高浓度的咪唑处理，通常需要额外的净化步骤，His标记的蛋白质通常会从固体支持物上释放出来。
[0005]目前一些技术通过利用NTA作为共聚单体将IMAC的基本概念纳入合成聚合物中。然而，这些设计并没有摆脱上述与IMAC相关的问题。虽然有市售的抗His标签抗体，但抗体固定柱比IMAC柱更昂贵。因此亟待开发一种无金属、有效的His
‑
tag亲和材料，可以用来代替金属离子固定化亲和色谱。

技术实现思路

[0006]本专利技术公开了一种用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法及用途。
[0007]所述的用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法为：将功能单体、交联剂、引发剂、表面活性剂配成混合反应液，将混合反应液加入到反应釜中，超声通氮气5
‑
30min脱除溶液中的氧气，搅拌反应合成聚合物颗粒，透析除去未反应的单体，得到用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体。
[0008]所述的功能单体选自N
‑
异丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸(AAc)、N
‑
叔丁基丙烯酰胺(TBAm)、N
‑
苯基丙烯酰胺(PAM)、N
‑
丙烯酰基L
‑
苯丙氨酸(AcPhe)中的一种或几种。
[0009]所述的交联剂为N,N'
‑
亚甲基双丙烯酰胺、N,N'
‑
乙烯基双丙烯酰胺和乙二醇二甲
基丙烯酸酯中的一种或几种。
[0010]所述的引发剂为过硫酸铵、偶氮二异丁腈或四甲基乙二胺。引发剂的用量为0.5
‑
2.0mg/mL。
[0011]所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵。所述的表面活性剂的用量为0
‑
1mg/mL。
[0012]所述的交联剂的质量是交联剂和功能单体总质量的1
‑
10wt％。
[0013]所述的搅拌反应在密封或氮气氛围下进行，反应温度为25℃
‑
80℃，反应时间为2
‑
72h。
[0014]上述的用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法中的混合反应液中还加入磁性四氧化三铁颗粒、聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球、环氧树脂微球、琼脂糖凝胶微球。
[0015]一种含His标签的酶或蛋白质的固定方法：将含有His标签的酶或蛋白质的样品，与用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体共孵育，离心或磁性分离去掉上清液，再与浓度为10
‑
500mM、pH＝7.0
‑
7.8的PBS缓冲液孵育洗脱除去非特异性吸附的不含His标签的酶或蛋白质，离心或磁性分离去掉上清液，剩下的载体上结合的只有含His标签的酶或蛋白质。
[0016]一种含His标签的酶或蛋白质的分离方法：将含有His标签的酶或蛋白质的样品，与用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体共孵育，离心或磁性分离去掉上清液，再与浓度为10
‑
500mM、pH＝7.0
‑
7.8的缓冲液孵育洗脱除去非特异性吸附的不含His标签的酶或蛋白质，离心或磁性分离去掉上清液，进一步利用浓度为10
‑
500mM、pH 8.0
‑
9.5的缓冲液孵育，即可实现含His标签的酶或蛋白质的无损伤可控释放，载体可重复使用。
[0017]本专利技术制备的载体通过选择性靶向识别His标签多肽可从发酵液等复杂样品中一步分离纯化和固定化含His标签的酶和蛋白质。该载体具有pH敏感性能，在中性pH选择性地捕获含His标签的酶和蛋白质，而在弱碱性pH相互作用大大减弱，从而可在温和条件下释放含His标签的酶和蛋白质，实现含His标签的酶和蛋白质的一步分离纯化与固定化，同时实现载体的再生利用。分离固定化对象可以为His标签酶和蛋白质的复杂样品或者其与任意样品的混合溶液。本专利技术利用载体的微环境性质，可以提高酶和蛋白质的活性并稳定其构象，而且载体中不含金属离子，对酶催化反应的产物和蛋白质的分离纯化没有金属离子污染，以上性能均优于传统的金属离子固定化亲和层析技术。
附图说明
[0018]附图1为实施例1制备的聚合物载体纳米颗粒(配方：NP13)的扫描电镜图。
[0019]附图2为实施例2中聚合物载体纳米颗粒(配方：NP13)从发酵粗酶液中一步分离纯化和固定化含His标签的苹果酸合成酶(GlcB)。1—maker，2—粗酶液，3—聚合物载体分离固载的含His标签GlcB。
[0020]附图3为实施例2中聚合物载体纳米颗粒(配方：NP13)从发酵粗酶液中一步分离纯化和固定化含His标签的多磷酸激酶(PZA)。1—maker，2—粗酶液，3—聚合物载体分离固载的含His标签PZA。
[0021]附图4为实施例2中聚合物载体纳米颗粒(配方：NP13)从发酵粗酶液中一步分离纯
化和固定化含His标签的乙酰辅酶A合成酶(Acs)。1—maker，2—粗酶液，3—聚合物载体分离固载的含His标签Acs。
[0022]附图5为实施例3制备的磁性载体(配方：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作为：将功能单体、交联剂、引发剂、表面活性剂配成混合反应液，将混合反应液加入到反应釜中，超声通氮气5
‑
30min脱除溶液中的氧气，搅拌反应合成聚合物颗粒，透析除去未反应的单体，得到用于含His标签的酶和蛋白质一步分离纯化与固定化的载体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的功能单体选自N
‑
异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、N
‑
叔丁基丙烯酰胺、N
‑
苯基丙烯酰胺、N
‑
丙烯酰基L
‑
苯丙氨酸中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂为N,N'
‑
亚甲基双丙烯酰胺、N,N'
‑
乙烯基双丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的引发剂为过硫酸铵、偶氮二异丁腈或四甲基乙二胺。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠或十六烷基三甲基溴化铵，所述的表面活性剂的用量为0
‑
1mg/mL。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂的质量是交联剂和功能单体总质量的1
‑
10wt％。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕永琴，马思佳，李燕，张童，范群凤，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：