用于酪氨酸酶介导的位点特异性蛋白质缀合的系统和方法技术方案

本公开提供生物分子与官能化反式环辛烯(TCO)的生物缀合。(TCO)的生物缀合。(TCO)的生物缀合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于酪氨酸酶介导的位点特异性蛋白质缀合的系统和方法
相关申请案的交叉引用本申请主张2020年5月5日递交的美国临时申请63/020,405的优先权，并且将其整体内容通过引用并入本申请案。

技术介绍

对天然氨基酸的位点特异性生物缀合仍然是化学家面临的挑战。通常很难用化学试剂从类似的邻近物识别如赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等表面丰富的氨基酸；除了在极少数情况下，氨基酸侧链的官能团压倒了空间或电子局部环境中任何可导致单个位点的反应动力学增强的细微变化。相反地，在蛋白质表面上安装不常见的氨基酸(特别是半胱氨酸)可提供位点选择性，该位点选择性可以用于位点特异性化学反应。通过酶实现了类似的特异性，该酶已进化为在独特的空间和电子环境中分离官能团。许多酶与氨基酸侧链反应。它们可用于安装或移除如磷酸盐、聚糖或脂质等翻译后修饰。对于生物缀合而言，这些酶中有用的亚类是用于组织交联者，因为该亚类是氨基酸序列特异性的。蛋白质化学家在转谷氨酰胺酶(TG)、甲酰甘氨酸生成酶(FGE)、分选酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)及漆酶等情况下利用了此特性。通过重组安装通过酶识别的氨基酸可实现位点特异性反应。酪氨酸酶也属于此类酶。酪氨酸酶将酪氨酸分两步骤氧化为二羟苯丙氨酸(DOPA)，接着氧化为DOPA的邻醌(多巴醌)。在自然界中，多巴醌既是真黑色素(eumelanin)的前体，也是与半胱氨酸、褐黑素(pheomelanin)、芳香族皮肤和毛发色素聚合物缀合使用的前体；在实验室中，科学家可利用这种反应来修饰重组蛋白。酪氨酸酶仅识别酪氨酸的酚侧链，并且能将其转化为邻醌，而无需侧翼氨基酸的特异性。重要的是，酪氨酸很少见于蛋白质表面；在这种少数情况下，其侧链往往会被疏水性堆积所阻塞。这导致非常少的酪氨酸残基，对于这些残基，酚充分地延伸以到达酪氨酸酶的活性位点。对此，有安装酪氨酸残基并实现位点特异性蛋白质修饰的可能。此方法已用于多种实例，包括通过Diels
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Alder环加成反应对细胞毒性货物进行缀合、对Cas9进行蛋白质
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蛋白质缀合以及对苯胺的氧化偶联进行分析。尽管在缀合方面取得了这些进展，但是产率和缀合产物的稳定性仍然是生物分子缀合中的问题。本公开提供满足这些和其他需求的实施例。

技术实现思路

在实施例中，提供了包括官能化反式环辛烯(TCO)与邻醌的环加合物的组合物，其中邻醌存在于生物分子中。在实施例中，提供了式(I)的组合物：
其中P为蛋白质或肽，且R包含第二蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚体、树枝状聚合物、标记物或基质表面，它们任选地通过接头连接。在实施例中，提供了以下方法，这些方法包括将官能化反式环辛烯(TCO)加入生物分子中存在的邻醌，从而形成官能化TCO与邻醌的环加合物。在实施例中，提供了以下方法，这些方法包括提供官能化反式环辛烯(TCO)、将包含酚类部分的蛋白质或肽加入官能化TCO；以及从该酚类部分生成邻醌，其中允许该官能化TCO与邻醌反应以形成环加合物。在实施例中，提供了以下抗体缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对抗体中酚类残基的作用而形成，其中该抗体缀合物在37℃在磷酸盐缓冲盐水中稳定至少一个月。在实施例中，提供了以下蛋白质缀合物，其是在官能化反式环辛烯(TCO)存在下通过酪氨酸酶对蛋白质中酚类残基的作用而形成，其中该蛋白质缀合物在37℃在磷酸盐缓冲盐水中稳定至少一个月。在实施例中，提供了包含具有酚类部分的生物分子、酪氨酸酶和官能化反式环辛烯的混合物。
附图说明
图1示出了在不同时间解析的质谱图，该质谱图表示出在经过工程化改造以显示含有酪氨酸残基的C末端肽标签的人IgG1 Fab中瞬态生成多巴醌。缺少酪氨酸的相同Fab不会导致修饰。图2A
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C示出了亲二烯体与原位多巴醌的缀合：在图2A列中示出了产物形成时间过程，顶部窗格示出了亲二烯体TCO，中间窗格显示亲二烯体BCN且底部窗格显示DBCO，每种试剂均作为用于含有原位生成多巴醌的Fab的捕获剂。还示出了瞬态地生成的邻醌(图2B列)及反应过程中生成的副产物Fab
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Fab二聚体(图C列)的相同时间过程。图3示出了典型反应及纯化过程的解卷积LCMS光谱，其展示了环加合物连接与标准实验室程序的兼容性。从上至下的光谱呈现：起始材料(含有C末端“DRY”肽标签的Fab)；在反应时间1小时后的反应，其呈现在M+432Da处(对应于+O、
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H2的14Da和TCO
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PEG4‑
COOH试剂的428Da)形成缀合产物；在反应时间16小时后的反应，其展示产率约为91％，从KappaSelect亲和性柱以pH 2.7洗脱后的纯化池，及在PBS中配制的最终产物。图4A
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B示出了由酪氨酸酶介导的生物缀合形成的Diels
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Alder环加合物在数个月的过程中对在pH 7.4、37℃的PBS中经工程化改造显示C末端肽标签的Fab的三个变体的稳定性，该标签为：DRY、DRGY和GGY。在每种情况下，缀合物均由对应于O原子增加(16Da)、H2损失(
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2Da)和TCO亲二烯体(TCO
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PEG4‑
羧酸，417.5)的质量增加的质量位移组成；计算出的总质量位移为431.5Da。对于Fab
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GGY，发现M+431.5；对于Fab
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DRY，发现M+431.6；对于Fab
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DRGY，发现431.7。每种Fab
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TCO
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PEG4‑
COOH缀合物均以PBS配制为5mg/mL，并通过0.22μm的注射器式过滤器在组织培养罩中灭菌。将容器在环境条件下密封，并在37℃下保存。在每个指定的时间点，从容器中取出一份等分样品，并通过LCMS分析其解除缀合。剩余的缀合物量计算为解卷积质量峰丰度的百分比。左窗格(图4A)示出了为Fab
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DRY蛋白质记录的LCMS光谱。缀合MW和Fab起始材料MW的峰丰度基本保持不变，但是Fab片段的丰度增加约1％，与失去C末端Tyr残基相对应(计算为M
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163.5，发现M
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163.6)。右窗格(图4B)是三个经工程化改造的缀合的Fabs在每个时间点剩余的缀合物量的总结。图5示出了基于图4的试剂生成的时间过程：近端Arg导致更快的初始速率(1小时)和更高的总产率。这样可将缀合效率从77％提高到92.5％。
具体实施方式
I.一般本公开涉及生物缀合反应，其通过从酪氨酸残基或相似的酚类部分以酶促生成反应性邻醌中间体来提供蛋白质的位点特异性修饰。如本文所公开的，酶促生成的邻醌与如环辛炔和环辛烯的亲二烯体快速地反应。尽管缀合加合物的产率和缀合物在生理pH和温度下的稳定性可变动，但本实施例已经找到了瞬态邻醌的可用反应伴侣(partner)，其提供良好的缀合物产率，且在生理条件下长时间稳定。II.定义除非另有具体说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，其包含官能化反式环辛烯(TCO)与邻醌的环加合物，其中所述邻醌存在于生物分子中。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物分子为蛋白质或肽。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物分子为寡糖。4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物分子为经修饰的DNA或RNA。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述邻醌来源于含酚部分。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述含酚部分为酪氨酸。7.根据权利要求6所述的组合物，其中将所述酪氨酸位点特异性地工程化改造至蛋白质中。8.根据权利要求5所述的组合物，其中所述含酚部分为儿茶酚。9.根据权利要求5所述的组合物，其中当所述生物分子为寡糖时，所述寡糖在其还原末端具有含酚部分。10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述官能化TCO包含蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物、诊断剂、双功能治疗诊断剂或基质表面，它们中的任何一种或多种任选地通过接头附接，其中所述接头任选地为支链的。11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述接头为支链的，且携带蛋白质、肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物、诊断剂、双功能治疗诊断剂或基质表面中的两者或更多者。12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述核酸为RNAi或反义寡核苷酸。13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述标记物为荧光团、放射性标记物、化学发光标记物、DNA条形码、RNA条形码或肽标签。14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述基质表面为聚合物珠粒、孔盘的孔底部或聚合物载玻片表面。15.一种式(I)的组合物：其中P为蛋白质或肽；并且R包含第二蛋白质、第二肽、药物、核酸、寡糖、聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、标记物或基质表面，它们中的任何一种任选地通过接头附接。16.根据权利要求15所述的组合物，其中P为抗体。17.根据权利要求15所述的组合物，其中P为抗体片段。18.根据权利要求15所述的组合物，其中P为酶。19.根据权利要求15所述的组合物，其中P为细胞表面蛋白。20.根据权利要求15所述的组合物，其中P为细胞因子。21.根据权利要求15所述的组合物，其中P为趋化因子。22.根据权利要求15所述的组合物，其中P为蛋白质毒素。
23.根据权利要求15所述的组合物，其中P为激素。24.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含抗体。25.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含靶向分子。26.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含治疗剂。27.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含放射性标记物。28.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含荧光标记物。29.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含磷光标记物。30.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含染料。31.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含聚合物珠粒。32.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其中R包含传感器表面。33.根据权利要求15至32中任一项所述的组合物，其中R包含接头。34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述组合物具有式(II)的结构：其中L为接头或键，且X为O、S或NH。35.根据权利要求33所述的组合物，其中所述组合物具有式(III)的结构：其中L为接头或键，且X为O、S或NH。36.一种方法，其包括：将官能化反式环辛烯(TCO)加至存在于生物分子中的邻醌，从而形成所述官能化TCO与所述邻醌的环加合物。37.一种方法，其包括：提供官能化反式环辛烯(TCO)；将包含酚类部分的蛋白质或肽加至所述官能化TCO；以及由所述酚类部分生成邻醌，其中允许所述官能化TCO与所述邻醌反应以形成环加合物。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：