一种睾丸类器官及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开一种睾丸类器官及其构建方法与应用，属于生物医药技术领域。采用三层梯度系统，将动物睾丸原代细胞重组为具有功能性血睾丸屏障的类器官

【技术实现步骤摘要】
一种睾丸类器官及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种睾丸类器官及其构建方法与应用，属于生物医药


技术介绍

[0002]生殖毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容，在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥了重要作用。近年来，随着不孕不育率逐年提高、男性精液质量呈下降趋势，药物的雄性生殖毒性应得到更多的重视。然而在传统的三段式药物生殖毒性研究中往往以雌性生殖和发育毒性评价为评价重点，而雄性生殖毒性仅是I段研究的一部分内容，往往未得到充分的关注与评价。
[0003]药物雄性生殖毒性，主要指药物对雄性生殖系统（睾丸、附睾等）及生殖功能造成损伤，一般包括生殖器官器质性改变、精子数量及质量下降、性行为改变、生育力降低、性激素分泌异常等，另外，还有往往易被忽视的通过精子遗传物质传递，和/或精液
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阴道摄入而产生的胚胎发育毒性。
[0004]2015年，FDA于《雄性介导的药物发育毒性风险评估指导原则》中提出，仅很少的临床指征可以用来监测潜在的睾丸毒性，故而临床睾丸毒性的评价存在困难。因此，对于睾丸毒性的评价，往往采用非临床睾丸毒性的评价方式，但非临床的雄性生育力研究不仅需要较高的动物成本，而且存在较多的干扰因素，例如：动物体重下降，影响动物神经肌肉功能、情绪等导致影响雄性交配行为和生育力，动物模型不合适导致该动物种属体内有不同的药动学特征等。同时，现有的细胞系评估方式，无法体现出不同生殖细胞间的交互联系和相互作用，而这种联系与作用对于精子发生的影响是非常重要的，故而，需要新的技术对非临床的雄性生育力及药物生殖毒性进行评估。
[0005]类器官被评为2017年Nature杂志的年度技术，并越来越多地被用于药物筛查、药物毒理学评估、分子疾病进展等领域的探讨。故，可以运用睾丸类器官芯片，模拟体外睾丸，体外直接观察药物对生精细胞的影响，且可探讨药物对睾丸组织内不同细胞之间交互联系的影响。用于毒性和功能分析的人3D显微组织类器官的构建，可以弥补目前公认的体外细胞培养模型与体内功能分析之间的差距。高通量3D人睾丸细胞培养系统可以模仿天然组织的基本功能且可进行功能的拓展，这是朝着发展更具预测性的药物筛选方式和减少对动物测试的依赖性迈出的第一步。然而，目前为止，睾丸类器官芯片的培养方法仍然不够明确，培养方案也各式各样。
[0006]现有技术CN112961822A公开了“一种睾丸类器官及其构建方法与应用”，以解决“体外三维琼脂培养只能分化到精母细胞阶段，并未得到具有功能的单倍体细胞及健康的后代”的技术问题，其中，采用聚合球培养液重悬睾丸细胞，而后将聚合球置于琼脂块上培养，涉及的聚合球培养液包含成分：MEMα、KOSR、L
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谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸钠、β
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巯基乙醇和GDNF，涉及的精原干细胞培养液包含组分：StemPro34基础培养液、非必需氨基酸、丙酮酸钠、L
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谷氨酰胺、β
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巯基乙醇、stemPro34 supplement、bFGF、LIF、EGF、GDNF，这就使得该培养基成分种类多且复杂，进而导致培养成本高，也容易出现因素不可控的现象；
CN114908032A中公开“一种类睾丸器官的制备、培养、冻存复苏方法及应用”，其通过悬滴悬浮培养方法即可获得睾丸类器官，且仅选用CCK
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8法，根据细胞增殖抑制情况判断药物的睾丸毒性。

技术实现思路

[0007]专利技术人在研究中，采用三层梯度系统（3
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LGS），将动物睾丸原代细胞重组为具有功能性血睾丸屏障的类器官
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生精小管组织，并可以建立和维持生殖细胞，该方法仅需要少量的基质胶和少量的细胞，就可促进体外对生殖细胞与体细胞关联的高通量分析。
[0008]此外，其中，通过在培养过程中，特别限定细胞数量和基质胶浓度，保证明显未见细胞过度凋亡，以及，不存在基质胶脱落等现象，较现有技术（如：Jan
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Bernd Stukenborg课题组，2018 年报道的睾丸类器官芯片）而言，培养状态更好，培养批次更稳定，这为睾丸类器官的应用提供了有效的前提保证，基于此，提出了一种睾丸类器官及其构建方法与应用。
[0009]为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：本技术方案目的一，提供：一种睾丸类器官的构建方法，包括如下步骤：1）获取20
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30天动物（小鼠或大鼠）睾丸组织，消化后得到细胞悬液，即获得睾丸细胞，保存（冰上），备用；2）将所得的细胞悬液离心，弃清液，得沉淀，保存（冰上），备用；3）采用基质胶稀释液吹打重悬所述沉淀，得细胞悬液基质胶，控制1μL细胞悬液基质胶中含有44000个睾丸细胞，保存（冰上），备用；其中，基质胶稀释液为：以体积比为1：1，将纯基质胶与MEM
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ɑ
（冰冷）混合，配制而成；4）取1μL所得的细胞悬液基质胶，悬滴到细胞小室（hanging cell inserts）膜上固化基质胶的正上方，孵育（二氧化碳培养箱）；其中，固化基质胶为：将纯基质胶垂直滴加到细胞小室膜（已高压灭菌）正中间，吹击使延展铺开，置于37℃的二氧化碳培养箱（5% ，CO2）中，孵育15min，固化，即得；5）取纯基质胶，垂直滴加到经步骤4）孵育后的固化基质胶的上方，孵育；同时，还取细胞悬液基质胶悬滴在新的hanging cell inserts膜正中间，以作为对照组；6）将经步骤5）孵育后的细胞小室浸入已预热（37℃）的含10% KSR的MEM
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ɑ
培养基中，培养5
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7d，得睾丸类器官，且得到具有完整血睾屏障的生精小管组织；其中，每隔一天更换一次已预热（37℃）的新鲜的含10% KSR的MEM
‑
ɑ
培养基。
[0010]本技术方案目的二，提供：一种睾丸类器官，采用上述构建方法获得。
[0011]进一步的，所述睾丸类器官包括间质细胞、支持细胞、精原细胞和精母细胞。
[0012]进一步的，所述睾丸类器官为生精小管组织。
[0013]本技术方案目的三，提供：将睾丸类器官在疾病模型构建及药物筛选中的应用。
[0014]进一步的，所述应用包括体外评估和/或筛选不同药物的生殖毒性。
[0015]进一步的，所述应用包括评估不同抗抑郁药物的生殖毒性比较。其中，药物包括抗抑郁药物米氮平和阿米替林。
[0016]进一步的，在不同药物的生殖毒性比较中，采用蛋白组学、转录组学、代谢组学、扫
描电镜技术、透射电镜技术、免疫荧光染色法、RT
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PCR法、蛋白免疫印迹（Western Blot）技术、免疫组化染色法、H
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E染色法、cck
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8测定细胞增殖法、IC50法、伊文思蓝染色法、Hoechest
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PI联合染色法和/或Ho本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种睾丸类器官的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1）获取动物睾丸组织，消化后得到细胞悬液，保存，备用；2）将所得的细胞悬液离心，弃清液，得沉淀，保存，备用；3）采用基质胶稀释液吹打重悬所述沉淀，得细胞悬液基质胶，控制1μL细胞悬液基质胶中含有44000个睾丸细胞，保存，备用；4）取1μL所得的细胞悬液基质胶，悬滴到细胞小室膜上固化基质胶的正上方，孵育；其中，固化基质胶为：将纯基质胶垂直滴加到细胞小室膜正中间，吹击，延展铺开，孵育，固化而成；5）取纯基质胶，垂直滴加到经步骤4）孵育后的固化基质胶的上方，孵育；6）将经步骤5）孵育后的细胞小室浸入已预热的含10% KSR的MEM
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ɑ
培养基中，培养，即得睾丸类器官。2.根据权利要求1所述的睾丸类器官的构建方法，其特征在于，在步骤3）中，所述基质胶稀释液为：以体积比为1：1，将纯基质胶与MEM
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ɑ
混合，配制而成。3.根据权利要求1所述的睾丸类器官的构建方法，其特征在于，在步骤6）的培养中，每隔一天更换一次已预热的含10% KSR的MEM
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ɑ
培养基。4.根据权利要求1所述的睾丸类器官的构建方法，其特征在于，在步骤6）中，培养时间为5
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7d。5.一种睾丸类器官，根据权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：吴思娴，许文明，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：