本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及一种TSEN2基因突变检测试剂盒、方法及系统；本方法包括提取怀孕母亲羊水样本，进行DNA提取；设计TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点的引物；进行PCR扩增；将PCR扩增后的产物进行纯化，再进行Sanger测序，经Blast比对，若发现碱基变异，则重复三次双向测序，判断TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点碱基是否变异；本发明专利技术通过设计引物，对TSEN2基因TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点进行突变检测，通过怀孕母亲羊水的检测，判断胎儿患脑桥小脑发育不良的几率，实现对胎儿患脑桥小脑发育不良的产前预测。发育不良的产前预测。
【技术实现步骤摘要】
Master Mix、9.5重量份ddH2O。
[0016]进一步，所述PCR扩增的反应条件为：94℃变性1分钟，以98℃5秒、55℃
‑
65℃5秒循环30次，72℃延伸1min。
[0017]进一步，通过全外显子测序验证所述TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点碱基是否变异。
[0018]一种用于检测TSEN2基因突变的试剂盒，包括所述引物。
[0019]进一步，所述试剂盒包括0.5重量份正向引物、0.5重量份反向引物、12.5重量份Fast PCR Master Mix、9.5重量份ddH2O。
[0020]一种TSEN2基因突变检测系统，包括提取模块、引物设计模块、PCR扩增模块和检测模块；
[0021]所述提取模块，用于提取怀孕母亲羊水样本，进行DNA提取；
[0022]所述引物设计模块，用于设计TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点的引物；
[0023]所述PCR扩增模块，用于进行PCR扩增；
[0024]所述检测模块，用于将PCR扩增后的产物进行纯化，再进行Sanger测序，经Blast比对，若发现碱基变异，则重复三次双向测序，判断TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点碱基是否变异。
[0025]进一步，还包括验证模块；所述验证模块用于通过全外显子测序验证所述TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点碱基是否变异。
[0026]所述用于检测TSEN2基因突变的试剂盒在制备检测脑桥小脑发育不良试剂中的应用。
[0027]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的TSEN2基因突变检测试剂盒、方法及系统，通过设计引物，对TSEN2基因TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点进行突变检测，通过怀孕母亲羊水的检测，判断胎儿患脑桥小脑发育不良的几率，并通过全外显子检测对检测结果进行验证，实现对胎儿患脑桥小脑发育不良的产前预测。
具体实施方式
[0028]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。
[0029]需要说明的是，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不是对本专利技术的限制，在本专利技术的构思前提下本方法的简单改进，都属于本专利技术要求保护的范围。
[0030]实施例
[0031]一种TSEN2基因突变检测方法，包括：
[0032]提取怀孕母亲羊水样本，进行DNA提取。
[0033]取1.5ml离心管，加入500ul细胞裂解液，取200ul含EDTA抗凝剂的全血加入到其中，涡旋20s；
[0034]加100ul蛋白沉淀液，涡旋10s，室温12000rpm离心8分钟；
[0035]取上清液移入离心管中再室温离心8分钟，弃滤液，加入适量洗涤液，室温静置后离心，去除滤液，加入800ul去盐液，静止后离心，再去滤液提取得到DNA，检测DNA浓度及纯度，可于
‑
80℃下保存。
[0036]设计TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点的引物。
[0037]引物序列如下：
[0038]位点正向序列反向序列TSEN2:c.926A>GTTAAGAGCATTTGTATTTGAGGTGACTTTTGCTCGAACAGTCCCACTSEN2:c.882_883insTGACATGTAGTGCTTCCATTTGTTCGCAGGCCTACTTGGGAGCTA
[0039]进行PCR扩增。
[0040]在PCR扩增仪上进行PCR扩增，反应体系如下：
[0041][0042][0043]其中正向引物为TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点的正向引物按1:1进行混合；同理反向引物一致。
[0044]PCR扩增条件为：94℃变性1分钟，以98℃5秒、55℃
‑
65℃5秒循环30次，72℃延伸1min。所有PCR产物均经2％琼脂糖凝胶电泳检测确认。
[0045]将PCR扩增后的产物进行纯化，再进行Sanger测序，经Blast比对，若发现碱基变异，则重复三次双向测序，判断TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点碱基是否变异。若存在TSEN2:c.926A>G或者TSEN2:c.882_883insT位点碱基变异，即胎儿为脑桥小脑发育不良患者。
[0046]通过全外显子测序验证所述TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点碱基是否变异。
[0047]全外显子测序包括：
[0048](1)采集怀孕母亲羊水样本，进行DNA提取。
[0049](2)DNA破碎，获得120
‑
150nbp的DNA片段。
[0050](3)进行末端修复，加入52μl的末端修复反应混合溶液，充分混匀后放入PCR仪，20℃，30分钟，后4℃保存。
[0051]末端修复反应混合溶液为：
[0052][0053][0054](4)3
’
端添加dA后进行纯化，DNA末端加接头，进行PCR扩增。
[0055]3’
端添加dA包括：配置腺苷酸化混合溶液，如下：
[0056]试剂体积Nuclease
‑
free water11μl10
×
Klenow Polymerase Buffer5μldATP1μlExo(
–
)Klenow3μl总计20μl
[0057]吸取腺苷酸化混合溶液20μl，混合30μlDNA样本进行PCR反应，反应程序如下：
[0058]步骤温度时间137℃30分钟24℃Hold
[0059]纯化包括：将磁珠放置室温30分钟以上，涡旋30s，向DNA中按1:18体积加入DNA纯化磁珠，经过涡旋、磁力架吸附、洗涤洗脱等过程纯化DNA样本。
[0060]DNA末端加接头包括：配置反应体系，如下：
[0061]试剂体积Nuclease
‑
free water15.5μl5
×
T4 DNA Ligase Buffer10μlDiluted SureSelect Adaptor Oligo Mix10μlT4 DNA Ligase1.5μl总计37μl
[0062]吸取37μl上述接头连接反应体系至DNA样本中，进行PCR反应，反应程序如下：
[0063]步骤温度时间120℃15分钟24℃Hold
[0064]进行PCR扩增包括：
[0065]配置PCR反应体系，如下：
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种TSEN2基因突变检测方法，其特征在于，包括：提取怀孕母亲羊水样本，进行DNA提取；设计TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点的引物；进行PCR扩增；将PCR扩增后的产物进行纯化，再进行Sanger测序，经Blast比对，若发现碱基变异，则重复三次双向测序，判断TSEN2:c.926A>G和TSEN2:c.882_883insT位点碱基是否变异。2.根据权利要求1所述TSEN2基因突变检测方法，其特征在于，所述引物包括：TSEN2:c.926A>G：正向引物TTAAGAGCATTTGTATTTGAGGTGA，反向引物CTTTTGCTCGAACAGTCCCAC；TSEN2:c.882_883insT：正向引物GACATGTAGTGCTTCCATTTGTTC，反向引物GCAGGCCTACTTGGGAGCTA。3.根据权利要求1所述TSEN2基因突变检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：2重量份DNA、0.5重量份正向引物、0.5重量份反向引物、12.5重量份Fast PCR Master Mix、9.5重量份ddH2O。4.根据权利要求1所述TSEN2基因突变检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：94℃变性1分钟，以98℃5秒、55℃
‑
65℃5秒循环30次，72℃延伸1min。5.根据权利要求1所述TSEN2基因突变检测方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，王芃芃，姬晓雯，
申请(专利权)人：迈基诺重庆基因科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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