一种培养间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种培养间充质干细胞的方法，其包括：步骤S1，利用组织样品培养获得间充质干细胞的原代细胞和/或传代细胞；步骤S2，将步骤S1中培养获得的所述原代细胞和/或所述传代细胞进行传代培养；步骤S3，在低氧条件下对步骤S2中培养获得的细胞进行培养；步骤S4，将步骤S3中培养获得的细胞在低氧高糖条件下进行培养；以及，步骤S5，将在步骤S4中培养生长的细胞进行激活培养。利用本发明专利技术的方法培养的间充质干细胞制备的细胞制剂具有长时间的细胞活率保持，同时在糖尿病治疗中具有更优的疗效。利用本发明专利技术方法培养的间充质干细胞在诱导胰岛细胞的过程中具有更高的转化率及胰岛素分泌能力。分泌能力。分泌能力。

【技术实现步骤摘要】
一种培养间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物医学领域，更具体地，涉及间充质干细胞的培养方法，尤其是一种适用于糖尿病治疗以及胰岛细胞分化用途的间充质干细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]I型糖尿病患者存在胰岛β细胞胰岛素分泌缺陷，需要依赖胰岛素来治疗。一些II型糖尿病患者在后期通过药物已经无法控制血糖，也需要依赖胰岛素。然而，依赖胰岛素的治疗只能延缓疾病的病程，并不能从根本上治愈糖尿病，随着疾病的进展，各种并发症会随之而来，将严重影响患者的生存质量。
[0003]大量研究结果证实，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)移植可以帮助患者恢复生理血糖控制，提高生活质量，是一种很有前景的治疗方法，同时由于间充质干细胞具有组织修复特性，对于患者的其它器官也能起到修复的作用。间充质干细胞是干细胞的一种，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，它最早被发现于骨髓中，因其能分化为间质组织而得名，其具有亚全能分化潜能，在一定条件下可诱导分化为多种组织细胞。同时由于MSC不表达MHC
‑Ⅱ
型分子，故其具有较低的免疫原性，在异体移植时不会引起排异反应。
[0004]研究表明将一定数量的MSC通过动脉导管注入到胰腺等组织中，在胰腺组织微环境的诱导下分化增殖为胰岛样细胞，替代损伤的胰岛β细胞合成胰岛素等功能，能起到治疗糖尿病的作用。亦有研究表明，MSC可通过旁分泌、细胞融合等机制改善胰岛细胞微环境，达到改善糖尿病的作用。但目前各种研究显示，单纯通过间充质干细胞或间充质干细胞联合一些药物治疗糖尿病虽然有一定的效果，但效果不显著，主要表现在经过一定周期治疗后，对患者血糖、C肽等关键性指标的检测中，变化不明显。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的一方面在于提供一种培养间充质干细胞的方法，所得到的间充质干细胞能够适用于糖尿病治疗及胰岛细胞分化用途，该方法包括：步骤S1，利用组织样品培养获得间充质干细胞的原代细胞和/或传代细胞；步骤S2，将步骤S1中培养获得的所述原代细胞和/或传代细胞进行传代培养；步骤S3，在低氧条件下对步骤S3中培养获得的细胞进行培养；步骤S4，将步骤S3中培养获得的细胞在低氧高糖条件下进行培养；以及，步骤S5，将步骤S4中培养获得的细胞进行激活培养。
[0006]优选地，在步骤S1，将步骤S1中培养获得的原代细胞和/或传代细胞在细胞于细胞培养液中在37℃、5％CO2条件下进行传代培养，所用的细胞培养液是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，其中细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为4～7mmol/L。步骤S1进一步优选在具有正常氧浓度的环境中进行，每2～4天更换一次细胞培养液。为了便于后续利用或构建细胞种子库，可以在原代细胞长满后进行冻存或传代后冻存，冻存的细胞代次优选为P0～P3代。
[0007]优选地，在步骤S2，将步骤S1中培养获得的原代细胞或传代细胞复苏后，于细胞培养液中在37℃、5％CO2条件下进行传代培养，连续培养1～3个代次。所用的细胞培养液优选是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，其中细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为4～7mmol/L。步骤S2进一步优选在具有正常氧浓度的环境(即，大气中氧浓度为21％
±
1％的环境)中进行，且优选避免在具有低氧浓度的环境中进行。
[0008]优选地，在步骤S3，所述低氧条件是培养环境中氧浓度为8～18％的条件，优选通过在培养箱内填充氮气来降低环境中的氧浓度使得达到氧浓度为8～18％的条件。将步骤S2中培养获得的细胞收集后，于细胞培养液中在37℃、5％CO2以及所述低氧条件下培养至细胞生长达到传代密度。所用的细胞培养液优选是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为4～7mmol/L。
[0009]优选地，在步骤S4，所述低氧高糖条件是培养环境中氧浓度为8～18％同时细胞培养液中葡萄糖终浓度为8～25mmol/L的培养条件，将步骤S3中培养获得的细胞于细胞培养液中在37℃、5％CO2以及低氧高糖的条件下培养至细胞生长达到传代密度。所用的细胞培养液优选是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为8～25mmol/L。
[0010]优选地，在步骤S5，将步骤S4中生长的细胞于细胞培养液中继续在37℃、5％CO2以及低氧高糖条件下培养至细胞融合度达到20％～80％时，加入胰高糖素样肽
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1或其类似物对细胞进行激活培养，其中培养体系中胰高糖素样肽
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1或其类似物的终浓度为5～100nmol/L。所用的细胞培养液优选是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为8～25mmol/L。优选地，加入胰高糖素样肽
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1或其类似物后将细胞继续培养至细胞融合度达到90～100％后，将细胞收集用于冻存、制备用于治疗糖尿病的细胞制剂或诱导培养成胰岛细胞。
[0011]优选地，所述胰高糖素样肽
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1或其类似物选自以下任何一种或多种：天然提取的胰高糖素样肽
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1或其类似物，利用通过基因重组技术原核或真核表达系统合成的胰高糖素样肽
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1或其类似物，或者通过化学方式合成的胰高糖素样肽
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1或其类似物。
[0012]优选地，所述组织样品选自脐带、胎盘、牙髓、脂肪或骨髓中的任意一种或多种。
[0013]本专利技术的专利技术人在研究中惊奇地发现，在间充质干细胞培养的不同阶段改变培养环境中的氧浓度，同时在培养体系中添加胰高糖素样肽
‑
1，能够大幅提高间充质干细胞治疗糖尿病的效果，同时在用药安全方面与传统的间充质干细胞无差异。并且，通过本专利技术的方法培养的间充质干细胞在诱导分化胰岛细胞方面，各项生物学指标也表现出明显提升。
[0014]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种培养间充质干细胞的方法，其包括：步骤S1，利用组织样品培养获得间充质干细胞的原代细胞和/或传代细胞；步骤S2，将步骤S1中培养获得的所述原代细胞和/或所述传代细胞进行传代培养；步骤S3，在低氧条件下对步骤S2中培养获得的细胞进行培养；步骤S4，将步骤S3中培养获得的细胞在低氧高糖条件下进行培养；以及，步骤S5，将在步骤S4中培养生长的细胞进行激活培养。2.根据权利要求1所述的培养间充质干细胞的方法，其特征在于：在步骤S1，于细胞培养液中在37℃、5％CO2条件下培养生长所述原代细胞和/或传代细胞，其中，所述细胞培养液是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，所述细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为4～7mmol/L。3.根据权利要求1所述的培养间充质干细胞的方法，其特征在于：在步骤S2，将在步骤S1中培养获得的所述原代细胞和/或所述传代细胞于细胞培养液中在37℃、5％CO2条件下进行传代培养，连续培养1～3个代次，其中，所述细胞培养液是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，所述细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为4～7mmol/L。4.根据权利要求1所述的培养间充质干细胞的方法，其特征在于：在步骤S3，将步骤S2中培养获得的细胞收集后，于细胞培养液中在37℃、5％CO2以及培养环境中氧浓度为8～18％的低氧条件下培养至细胞达到传代密度，其中，所述细胞培养液是额外添加有0.1～0.5％(v/v)人血白蛋白、0.2～2％(v/v)的胰岛素
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转铁蛋白
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硒、2～10％(v/v)人源血小板裂解液以及0.1～0.5％(v/v)B27的低糖DMEM培养基，所述细胞培养液中的葡萄糖终浓度调整为4～7mmol/L。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：王意忠，孙岳，张社毅，
申请(专利权)人：王意忠，
类型：发明
国别省市：