干细胞分化为心肌细胞的培养方法和培养基技术

本发明专利技术提供了诱导哺乳动物万能干细胞(包括胚胎干细胞或诱导万能干细胞)分化为心肌细胞的培养方法，所述方法包括将万能干细胞制备拟胚体EB，然后将拟胚体在心肌细胞分化培养液中培养。本发明专利技术还提供了用于诱导哺乳动物万能干细胞向心肌细胞分化的培养液。干细胞向心肌细胞分化的培养液。干细胞向心肌细胞分化的培养液。

【技术实现步骤摘要】
干细胞分化为心肌细胞的培养方法和培养基
[0001]本申请要求2021年6月24日提交的、申请号为202110704008.6、专利技术名称为“干细胞分化为心肌细胞的培养方法和培养基”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本专利技术涉及干细胞培养方法和细胞培养基领域。具体的，本专利技术提供了一种诱导万能干细胞(包括胚胎干细胞或诱导万能干细胞)分化为心肌细胞的培养方法和细胞培养基。

技术介绍

[0003]心脏病如缺血性心脏病、心肌梗死、心力衰竭和心肌病等已成为当今临床上常见病。人体心肌组织中干细胞数量有限，分化能力差，心肌细胞坏死或凋亡后，心肌难以修复，进而出现心肌细胞数量减少、心室重构、心律失常等，最终出现心力衰竭。人类致力于为心血管疾病患者寻找更有效的药物，大量的研究工作致力于实现这个目标。例如，已经开发多个生物模型和工具，包括多能干细胞、离子通道分析和计算工具的使用，尤其是，在开发创新预测分析以改正药物开发期间相关问题中，衍生自多能干细胞的心肌细胞的使用是目前关注的焦点。
[0004]心肌细胞来源于胚胎发育过程中的中胚层。万能干细胞是能够产生所有的胚胎细胞类型的干细胞。万能干细胞包括胚胎干细胞和诱导万能干细胞。胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)起源于早期哺乳动物胚胎的内细胞团(Martin,1981；Thomson et al.,1998)，其具有自我更新的能力，并且能够分化成为三个胚层的典型细胞类型(Medvedev et al.,2010)。1981年，英国科学家马丁
·
埃文斯首次建立了小鼠胚胎干细胞系，开启了胚胎干细胞领域的研究工作(Evans and Kaufman，1981)。诱导万能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，也称为诱导多能干细胞或人工万能干细胞，是人工制备的具有胚胎干细胞的干性的细胞。
[0005]本领域已经公开了多种从万能干细胞分化得到心肌细胞的方法。例如M.A.Laflamme等，Nat.Biotechnol.，2007报道了在激活素A和BMP4有助于生成高度纯化的人心肌细胞，并且可以用大量来自ESC的心肌细胞修复梗塞的心脏。X.Lian等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2012报道了经典WNT信号的时间调节有助于从人类多能干细胞中分化出强大的心肌细胞。M.Ieda等,Cell 2010报道了小鼠成纤维细胞可以使用多种转录因子(如Gata4、Mef2c和Tbx5)转分化为心肌细胞。N.Cao等,Science2016报道了用九种化合物的组合处理后，可以从人类成纤维细胞中产生心肌细胞样细胞。近年在干细胞培养和分化中，最常用的是在胚胎干细胞培养过程中使用MEK和GSK3抑制剂(PD0325901和CHIR99021)的无血清培养基条件(2i+Lif,2iL)。
[0006]然而，已知的分化得到心肌细胞的方法需要加入昂贵的细胞因子，阻碍了有效和方便地获得心肌细胞的应用。诱导细胞分化为心肌细胞的方法有待进一步完善和更新。本
领域还需要开发新的通过干细胞分化得到心肌细胞的制备方法和培养基。

技术实现思路

[0007]本申请提供了新的诱导万能干细胞(包括胚胎干细胞或诱导万能干细胞)分化为心肌细胞的培养方法和培养基系统。本申请人的专利技术人出乎意料地发现通过本专利技术的方法可以不需要在培养基中加入生长因子，能够有效促进万能干细胞向心肌细胞的分化。
[0008]具体的，本专利技术提供了一种用于诱导哺乳动物万能干细胞向心肌细胞分化的培养方法，其包括以下步骤：
[0009]步骤1：将万能干细胞制备拟胚体EB培养悬滴，培养约5天(
±
6小时)，得到拟胚体；
[0010]步骤2：将步骤1培养得到的拟胚体EB在心肌细胞分化培养液中重悬后培养约2天(
±
4小时)；其中所述心肌细胞分化培养液为包含N
‑
2补充液的DMEM培养液；
[0011]步骤3：将步骤2培养得到的细胞进行贴壁培养，在所述心肌细胞分化培养液中进行培养。
[0012]在本专利技术的其中一个方面，所述方法在体外进行。在本专利技术的另一个方面，本专利技术方法在体内进行。在一些实施方式中，本专利技术方法在体外进行时，随后将心肌细胞引入活生物体。
[0013]本文使用的术语“哺乳动物”指的是哺乳纲的任何成员，包括但不限于：人类和非人灵长类，如黑猩猩和其它猿类和猴类；农场动物如牛、羊、猪、山羊和马；家畜如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。优选的，本专利技术的方法适合用于小鼠或大鼠，特别是适用于小鼠。
[0014]本文使用的术语“干细胞”或“万能干细胞”指的是通过它们在单个细胞水平自我更新和分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非自我更新的祖细胞和末端分化细胞。干细胞具有在培养时无限期分裂的能力。干细胞的特点也在于它们在体外从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成不同细胞谱系的功能细胞的能力。干细胞分类为成体(somatic)干细胞或胚胎干细胞。成体干细胞是在分化组织中发现的未分化细胞，可自我更新(克隆)和(有一定的限制)分化以获得它所起源的组织的所有特定细胞类型。
[0015]万能干细胞包括胚胎干细胞和诱导万能干细胞。胚胎干细胞(embryonic stemcells，ESC)，是指的是衍生自囊胚的内细胞团的多能胚胎干细胞，其为衍生自早期胚胎的多能干细胞。胚胎干细胞可分化为衍生自三个胚层中的任何一个胚层的细胞。本文使用的术语“多能性”是技术人员通常理解的，并且指的是具有分化为组成一种或多种组织或器官的所有细胞潜能的多能干细胞的属性。
[0016]诱导多能干细胞，通常缩写为iPSC，指的是通过被迫表达对保持胚胎干细胞的“干性(stemness)”重要的因子而重编程以进入胚胎干细胞样状态的成体(成体)细胞。通常，iPSC通过以下方式由非多能性细胞(如成人体细胞，或末端分化细胞)，例如纤维原细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等人工制备，即通过将所述非多能性细胞引入重编程因子，或使所述非多能性细胞与所述重编程因子接触。术语“诱导多能干细胞(iPSC)”一般不包括胚胎干细胞。
[0017]在本专利技术中，术语心肌细胞通常指的是任何心肌细胞谱系细胞，并且可适用于处
于心肌细胞个体发育的任何阶段的细胞。例如，心肌细胞可同时包括心肌细胞前体细胞(不成熟的心肌细胞或胎儿心肌细胞)和成熟的心肌细胞(成体样心肌细胞)。
[0018]在本专利技术的其中一个方面，所述诱导万能干细胞向心肌细胞分化的培养方法适合用于诱导胚胎干细胞或诱导万能干细胞向心肌细胞分化。
[0019]在本专利技术的其中又一个方面，所述诱导万能干细胞向心肌细胞分化的培养方法适合用于诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。
[0020]在本专利技术的其中一个方面，前述方法的步骤1中以干细胞培养液来培养拟胚体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于体外诱导哺乳动物万能干细胞(例如胚胎干细胞或诱导万能干细胞)向心肌细胞分化的培养方法，其包括以下步骤：步骤1：将万能干细胞制备拟胚体EB培养悬滴，培养约5天(
±
6小时)，得到拟胚体；步骤2：将步骤1培养得到的拟胚体EB在心肌细胞分化培养液中重悬后培养约2天(
±
4小时)；其中所述心肌细胞分化培养液为包含N
‑
2补充液的DMEM培养液；步骤3：将步骤2培养得到的细胞进行贴壁培养，在所述心肌细胞分化培养液中进行培养。2.权利要求1的方法，其中步骤1中以干细胞培养液来培养拟胚体EB，优选为DMEM培养基，最优选为含F12的DMEM培养基(例如为含有GlutaMAX和丙酮酸钠的DMEM/F12)。3.权利要求1或2的方法，其中步骤1中拟胚体EB培养悬滴中的培养液不含有MEK和GSK3通路抑制剂如PD0325901、CHIR99021，和/或不含有白血病抑制因子LIF。4.权利要求1的方法，其中所述心肌细胞分化培养液中所述DMEM培养基为含F12的DMEM培养基(例如为含有GlutaMAX和丙酮酸钠的DMEM/F12)，优选的，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：路钢，陈伟仪，王武明，苏献伟，周竞叶，刘强，
申请(专利权)人：卓越细胞工程香港有限公司，
类型：发明
国别省市：