一种发酵生产L-谷氨酰胺的方法技术

本发明专利技术提供了一种发酵生产L

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，尤其是一种发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法。

技术介绍

[0002]L
‑
谷氨酰胺(L
‑
Glutamine,L
‑
Gln)化学名为2,5
‑
二氨基
‑5‑
氧代戊酸，分子式为C5H
10
N2O3，相对分子量为146.15，结晶形状为白色斜方晶体或结晶性粉末状，无臭，有独特的甜味。易溶于水，几乎不溶于乙醇，氯仿等多种有机溶剂，熔点为185℃，等电点为5.65，具有热不稳定性，遇热或酸碱易变性。L
‑
谷氨酰胺含有两个氨基，一个是α
‑
氨基，一个是末端酰胺基。由于末端酰胺基易水解，使L
‑
谷氨酰胺不仅是生物体内嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸、核酸和其他氨基酸生物合成的必须原料之一，还是各器官间氮流动的重要载体。
[0003]近年来，随着对L
‑
谷氨酰胺的深入研究，L
‑
谷氨酰胺被广泛应用于医药，保健食品，饲料等领域。作为一种具有潜力的新药，L
‑
谷氨酰胺在临床上主要应用于治疗胃肠溃疡，缓解运动疲劳，改善脑神经机能等方面。随着对L
‑
谷氨酰胺生理作用以及应用范围的深度研究，L
‑
谷氨酰胺的需求量和生产量都在不断增加，且药用需求量很大，具有广阔的市场前景。L
‑/>谷氨酰胺的工业生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法，其中发酵法生产L
‑
谷氨酰胺是目前使用的主要方法。
[0004]常见的L
‑
谷氨酰胺发酵培养基添加大量的(NH4)2SO4，导致NH
4+
浓度过高，导致发酵过程中菌体活力大大下降，抑制L
‑
谷氨酰胺合成酶活性，产酸效率下降，副产物谷氨酸生成较多，造成提取困难、成本偏高等问题。
[0005]此外，目前的发酵法生产L
‑
谷氨酰胺，由于发酵初期的培养基浓度过高，产生对菌体过高的渗透压，使菌体生长缓慢,发酵周期延长。发酵中后期，发酵液中营养物质消耗不均，营养物质不平衡，可能缺少或积累某种营养，导致菌体活力下降，生长变慢过早衰亡，产酸效率低，副产物也会随之增加，发酵周期延长，经济效益降低。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：
[0008]一种发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，具体步骤如下：
[0009](1)将谷氨酸棒杆菌接种到斜面培养基活化，接入摇瓶利用种子培养基进行一级种子培养；
[0010](2)一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养以及发酵培养，发酵过程中NH
4+
限制发酵工艺、全营养分割强迫发酵工艺。
[0011]优选的，上述发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，具体步骤如下：
[0012](1)将谷氨酸棒杆菌T
‑
6接种到斜面培养基活化，活化条件：32℃，12h；
[0013](2)将斜面活化的菌种接入摇瓶进行一级种子培养，34℃，pH7.0，220rmp/min，摇床培养10h，一级种子培养基体系100mL；一级种子液全部接入发酵罐内进行二级种子培养，
34℃，pH7.0，溶氧30
‑
50％，培养至OD
600
达到40，二级种子培养基体系2L；
[0014](3)发酵初始培养基用水定容至1.3L(发酵初始体系为2L，包括600mL二级种子液，100mL 60％葡萄糖和1.3L发酵初始培养基)；发酵流加培养基定容300mL(发酵流加培养基体系为300mL，装入瓶中待流加)；当二级种子培养完成，将二级种子液放出至剩余600mL，加入提前配制并定容好的1.3L发酵初始培养基和100mL浓度为80％的葡萄糖(定容至2.0L)；流加培养基从发酵4h开始流加至发酵结束前8h；
[0015](4)将300g的(NH4)2SO4溶于600mL水中，从发酵3h开始均匀流加至发酵结束；
[0016](5)种子培养基中添加的尿素用来调节种子培养阶段和发酵培养初期的pH，1.5g/L的尿素可以使种子培养阶段全程pH维持在7.0
‑
7.2，并在发酵培养初期将pH维持在7.0
‑
7.2直至pH开始自然下降(大约发酵3h左右)，开始使用25％的氨水调节发酵培养过程中的pH值维持在6.4；
[0017](6)发酵过程中流加补料的葡萄糖中加入3g/L甜菜碱，各0.5mg/L的V
B1、3、5、12
、2g/L氯化胆碱、赤霉素10mg/L、磷酸吡哆醛5mg/L。
[0018]优选的，上述发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，所述斜面培养基为：牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO
4 1g/L、MgSO
4 0.5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉25g/L。
[0019]优选的，上述发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，所述种子培养基为：葡萄糖30g/L、豆浓40mL/L、K2HPO4·
3H2O 2.5g/L、MgSO4·
7H2O 0.9g/L、V
H 20μg/L、FeSO
4 5mg/L、MnSO
4 5mg/L、Vb
1,3,5,12
各0.5mg/L、尿素1.5g/L。
[0020]优选的，上述发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，所述发酵初始培养基为：葡萄糖30g/L、K2HPO4·
3H2O 3g/L、Vb
1,3,5,12
各0.25mg/L、豆浓50mL/L、MnSO
4 10mg/L、FeSO
4 10mg/L、ZnSO
4 5mg/L、MgSO4·
7H2O 2g/L、V
H 4μg/L、糖蜜1.1g/L。
[0021]优选的，上述发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，所述发酵流加培养基为：葡萄糖30g/L、K2HPO4·
3H2O 3g/L、Vb
1,3,5,12
各0.25mg/L、MnSO
4 10mg/L、FeSO
4 10mg/L、ZnSO
4 5mg/L、MgSO4·
7H2O 2g/L、糖蜜1.1g/L。
[0022]优选的，上述发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，所述谷氨酸棒杆菌T
‑
6是通过菌株CGMCC No.1.16145(菌株TCCC 11822)经过基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)将谷氨酸棒杆菌接种到斜面培养基活化，接入摇瓶利用种子培养基进行一级种子培养；(2)一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养以及发酵培养，发酵过程中NH
4+
限制发酵工艺、全营养分割强迫发酵工艺。2.根据权利要求1所述的发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)将谷氨酸棒杆菌T
‑
6接种到斜面培养基活化，活化条件：32℃，12h；(2)将斜面活化的菌种接入摇瓶进行一级种子培养，34℃，pH7.0，220rmp/min，摇床培养10h，获得一级种子培养基体系；一级种子液全部接入发酵罐内进行二级种子培养，34℃，pH7.0，溶氧30
‑
50％，培养至OD
600
达到40，获得二级种子培养基体系；(3)每2L二级种子培养基体系中，发酵初始培养基用水定容至1.3L；发酵流加培养基定容300mL；当二级种子培养完成，将二级种子液放出至剩余600mL，加入提前配制并定容好的1.3L发酵初始培养基和100mL浓度为80％的葡萄糖；流加培养基从发酵4h开始流加至发酵结束前8h；(4)将300g的(NH4)2SO4溶于600mL水中，从发酵3h开始均匀流加至发酵结束；(5)种子培养基中添加的尿素用来调节种子培养阶段和发酵培养初期的pH，1.5g/L的尿素可以使种子培养阶段全程pH维持在7.0
‑
7.2，并在发酵培养初期将pH维持在7.0
‑
7.2直至pH开始自然下降，开始使用25％的氨水调节发酵培养过程中的pH值维持在6.4；(6)发酵过程中流加补料的葡萄糖中加入3g/L甜菜碱，各0.5mg/L的V
B1、3、5、12
、2g/L氯化胆碱、10mg/L赤霉素、5mg/L磷酸吡哆醛。3.根据权利要求2所述的发酵生产L
‑
谷氨酰胺的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，陈志超，刘云鹏，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：