卒中检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种卒中检测试剂盒及其应用，包括酶标反应板、检测抗体、标准品、酶标亲和素、检测抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、终止液、显色液，其特征在于：所述检测抗体为生物素标记的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体，所述标准品为尤瑞克林，所述酶标亲和素为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。本发明专利技术在延用生物素

【技术实现步骤摘要】
卒中检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及人组织激肽释放酶检测
，具体地指一种卒中检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]人组织激肽释放酶(TK)是一类丝氨酸蛋白酶，能促进低分子激肽原释放血管活性肽从而发挥一系列生物活性作用，命名为KLK1。国内外已有200多项研究探讨了TK对脑卒中的治疗价值。国内外的团队分别通过多种心脏病例对照研究和大规模的横断面研究发现血浆中TK水平与卒中的发生及预后负相关，降低的血浆TK水平能预测缺血性卒中的风险，其灵敏性为87％，特异性为87％，正确指数为0.741。因此，建立一项TK水平快速检测的试剂盒有助于卒中的诊断及预后的评估。
[0003]鉴于TK对脑卒中的预测及治疗价值，申请人前期制备过TK检测的双抗体夹心ELISA试剂盒(CN101672851A)和活性检测试剂盒(CN104049082A)。但是CN101672851A采用的是双抗体夹心ELISA法，检测步骤较多，耗时4.5小时，而不利于大批量检测。CN104049082A检测的是TK的活性，而样品中的TK蛋白不易降解，但容易失活，因此也具有局限性。这两项试剂盒耗时太久，方法复杂，不利于大批量检测。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种卒中检测试剂盒及其应用。本专利技术在延用生物素
‑
亲和素放大系统和特异性单抗的同时，引入已商品化的高纯度标准品，同时优化检测方法，将原来的4.5小时的检测时间缩短到1.5小时，从而大量节省了人力成本，并提升了产品质量。
[0005]为达到上述目的，本专利技术通过下述技术方案实现：
[0006]一方面，本专利技术提供一种卒中检测试剂盒，包括酶标反应板、检测抗体、标准品、酶标亲和素、检测抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、终止液、显色液，其特征在于：所述检测抗体为生物素标记的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体，所述标准品为尤瑞克林，所述酶标亲和素为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。
[0007]优选地，检测灵敏度为5
‑
500nM。
[0008]优选地，所述洗涤液的pH值为7.4，浓度为0.15M，所述洗涤液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、NaCl、KCl、Tween
‑
20和蒸馏水配制而成。
[0009]优选地，所述样品稀释液的pH值为9.6，浓度为0.05M，所述样品稀释液由Na2CO3、NaHCO3、牛血清白蛋白和蒸馏水配制而成。
[0010]优选地，所述检测抗体稀释液的pH值为7.4，浓度为0.15M，所述检测抗体稀释液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、NaCl、KCl和蒸馏水配制而成。
[0011]优选地，所述终止液浓度为2M，所述终止液由浓硫酸和蒸馏水配制而成。
[0012]优选地，所述显色液由四甲基联苯胺TMB、底物缓冲液和H2O2配制而成，所述底物缓
冲液为pH值为5.5的磷酸盐柠檬酸溶液。
[0013]优选地，所述底物缓冲液由Na2HPO4、柠檬酸和蒸馏水配制而成。
[0014]另一方面，本专利技术提供一种卒中检测试剂盒在检测血浆中人组织激肽释放酶含量的应用。
[0015]优选地，试剂盒在检测血浆中人组织激肽释放酶含量的方法，包括以下步骤：
[0016]1)倍比稀释标准品，分别向反应板中加入标准品及1：100倍稀释的血浆；
[0017]2)加入1:2000倍稀释的检测抗体，于室温摇床上360转/分钟，反应60分钟；
[0018]3)加入1：2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，反应25分钟，TMB显色终止并读数；
[0019]4)结果判断，空白调零，读取450nm波长处吸光度，绘制标准曲线；
[0020]5)计算结果，根据标准曲线计算出血浆中人组织激肽释放酶的含量。
[0021]本专利技术与现有技术相比，具有如下优点及有益效果：
[0022]本专利技术在延用生物素
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亲和素放大系统和特异性单抗的同时，引入已商品化的高纯度标准品尤瑞克林。由于尤瑞克林已经应用缺血性脑卒中的补充治疗，直接利用补充用药作为标准品，更能直观地判断患者是否需要尤瑞克林的补充治疗。
[0023]本专利技术对检测方法进行优化，将原来的4.5小时的检测时间缩短到1.5小时，从而大量节省了人力成本，并提升了产品质量，有利于临床的广泛应用。本项目首先通过优化了抗原的吸附条件，相对于传统试剂盒来说减少了包被抗体包被ELISA反应板和封闭液封闭的步骤，从而将操作时间从以前的4.5小时缩短到了1.5小时。此外，本试剂盒的ELISA反应板在室温保存即可，为该试剂盒的保持提供了便利。
附图说明
[0024]图1是蛋白质印迹(Western blot)检测的内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的表达；
[0025]图2为蛋白质印迹(Western blot)检测的人组织激肽释放酶(TK)的表达；
[0026]图3为本专利技术试剂盒的标准曲线图。
具体实施方式
[0027]以下结合附图、实施例和实验例对本专利技术作进一步的详细描述。当然，本专利技术的保护范围并不限于下述实施例。本领域专业技术人员能够理解，在不背离本专利技术精神的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。本专利技术对实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本专利技术目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但本专利技术仍然在此作尽可能详细的描述。以下实施例是进一步说明本专利技术，而不是限制本专利技术。任何依据本专利技术构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本专利技术技术方案的范畴。
[0028]下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。
[0029]实施例1
[0030]1、试剂及实验仪器的准备
[0031]1.1试剂
[0032]1)洗涤液(pH7.4，0.15M)，0.2克KH2PO4，2.9克Na2HPO4·
12H2O，8.0克NaCl，0.2克KCl，0.5ml、0.1％Tween
‑
20，加蒸馏水至1000ml；
[0033]2)样品稀释液(pH 9.6，0.05M)，1.59克Na2CO3，2.93克NaHCO3，1克牛血清白蛋白(BSA)，加蒸馏水至1000ml；
[0034]3)标准品：天普公司提供的尤瑞克林；
[0035]4)生物素化单克隆抗体：生物素标记的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体，为已知抗体；
[0036]5)抗体稀释液(pH7.4，0.15M)0.2克KH2PO4，2.9克Na2HPO4·
12H2O，8.0克NaCl，0.2克KCl，加蒸馏水至1000ml；
[0037]6)酶标亲和素：辣根过氧化物酶标记链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种卒中检测试剂盒，包括酶标反应板、检测抗体、标准品、酶标亲和素、检测抗体稀释液、样品稀释液、洗涤液、终止液、显色液，其特征在于：所述检测抗体为生物素标记的抗人组织激肽释放酶单克隆抗体，所述标准品为尤瑞克林，所述酶标亲和素为辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。2.根据权利要求1所述的卒中检测试剂盒，其特征在于：检测灵敏度为5
‑
500nM。3.根据权利要求1所述的卒中检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤液的pH值为7.4，浓度为0.15M，所述洗涤液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、NaCl、KCl、Tween
‑
20和蒸馏水配制而成。4.根据权利要求1所述的卒中检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液的pH值为9.6，浓度为0.05M，所述样品稀释液由Na2CO3、NaHCO3、牛血清白蛋白和蒸馏水配制而成。5.根据权利要求1所述的卒中检测试剂盒，其特征在于：所述检测抗体稀释液的pH值为7.4，浓度为0.15M，所述检测抗体稀释液由KH2PO4、Na2HPO4·
12H2O、N...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琴，冉晓，汪道文，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：