一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，包括如下步骤：S1制备Au@IR808@抗体的免疫拉曼信号金纳米粒子；S2制备生物素化抗体Ab2；S3制备免疫夹心复合物；S4洗涤液磁吸

【技术实现步骤摘要】
一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法


[0001]本专利技术属于生物免疫分析检测领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，用于检测新型冠状病毒的核壳蛋白基因(nucleocapsid protein，N)。

技术介绍

[0002]新型冠状肺炎病毒SARS
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CoV
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2的检测方法中的病原学及血清学检查主要有核酸检测、抗体检测、抗原检测。其中，核酸检测是SARS
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CoV
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2检测的“金标准”，但存在耗时较长、无法现场检测的缺点。抗体检测不能单独用于新冠病毒诊断，不能排除感染或说明感染状态，而抗原检测是核酸检测非常重要的补充，通过抗原检测可以更早发现阳性感染者，尽早隔离并进行核酸复核，最大限度实现早发现、早报告、早隔离。
[0003]现有的检测方法例如：
[0004]CN202011431411.8公开了一种检测新冠病毒及其突变体的试剂盒，其特征在于，包括如下部分：(1)前底物A链和前底物B链；(2)Cas 13a蛋白；(3)crRNA或其DNA模板；(4) 核酸连接酶；(5)点亮型RNA适体或其DNA模板；(6)体外转录试剂。
[0005]CN202110353115.9公开了采用Pt
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Pd合金纳米颗粒标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其检测方法和应用。所述的检测新冠病毒的试剂盒，含有新冠病毒SARS
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CoV
‑<br/>2中和抗体Pt
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Pd合金纳米颗粒试纸条。所述新冠病毒SARS
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CoV
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2中和抗体 Pt
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Pd合金纳米颗粒试纸条的制备方法为用合金纳米颗粒标记新冠病毒SARS
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CoV
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2抗原作为捕获抗体纳米标记物，再将纯化的A型表达抗原及其抗体包被在纤维素膜上，分别作为检测线T线和质控线C线，经条件优化，建立新冠病毒中和抗体Pt
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Pd合金纳米颗粒试纸条。
[0006]相比核酸检测，抗原检测的速度更快、操作也更方便，作为补充手段可以用于特定人群的筛查，有利于提高“早发现”能力。并且成本更低，速度更快，能在10
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20min内获得结果。因此，抗原检测更适合于早期大规模筛查，能够与核酸检测、抗体检测、CT检测相互印证，成为新冠肺炎排查的重要手段。但现有的快速抗原检测试剂盒存在检测灵敏度不够导致假阴性以及检出率不高等问题，因此，急需一种更快速、检测灵敏度更高且稳定的快速抗原检测手段。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，弥补现有检测新型冠状病毒技术的不足，提供一种基于表面增强拉曼光谱快速灵敏检测新型冠状病毒N蛋白的方法。本专利技术利用免疫拉曼信号金纳米粒子与SARS
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CoV
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2N蛋白以及生物素化抗体Ab2在液相中的高结合效率，实现对N蛋白的特异性识别捕获形成“双抗”免疫复合物，再借助链霉亲和素与生物素的高亲和力，通过修饰了链霉亲和素的磁珠捕获上一步形成的免疫复合物，形成“免疫拉曼信号金纳米粒子—N蛋白—生物素化抗体—链霉亲和素化磁珠”结构的免疫夹心复合物，拉
曼光谱仪在15min内实现对SARS
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CoV
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2病毒N
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蛋白的超灵敏稳定快速检测。
[0008]为了实现以上目的，本专利技术的技术方案之一为：一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，具体包括如下步骤：
[0009]S1：将拉曼信号分子和SARS
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CoV
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2病毒N蛋白抗体Ab1分别偶联到金纳米粒子上，制备Au@IR808@抗体的免疫拉曼信号金纳米粒子；
[0010]S2：将生物素与抗体Ab2偶联，制备生物素化抗体Ab2(Bio
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Ab2)；
[0011]S3：将步骤S1制得的免疫拉曼信号金纳米粒子与步骤S2制得的生物素化抗体Ab2以及新型冠状病毒N蛋白稀释液混合孵育，再与链霉亲和素化磁珠混合孵育，获得免疫夹心复合物；
[0012]S4：将步骤S3中的免疫夹心复合物用洗涤液磁吸
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洗涤数次，并最终浓缩定容至小体积；
[0013]S5：将S4中的小体积液体滴于表面增强拉曼芯片上进行拉曼检测。
[0014]优选地，所述步骤S1中免疫拉曼信号金纳米粒子通过下述方法制备：将金纳米粒子与拉曼信号分子搅拌下混合，室温孵育，离心，弃去上层清液，并用缓冲液洗涤一次并定容，加入EDC((1
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乙基
‑3‑
[3
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二甲氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐)和NHS(N
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羟基丁二酰亚胺)溶液活化，离心后洗涤，并用缓冲液定容，加入SARS
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CoV
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2病毒N蛋白抗体Ab1，过夜孵育结合，离心，弃去上层清液，加入封闭液孵育，洗涤离心，弃去上层清液，最后重新分散在保存液中，制得免疫拉曼信号金纳米粒子。
[0015]更进一步地，所述缓冲液为BB缓冲液，其用硼砂和氢氧化钠配制而成，pH为7.2
‑
7.6。
[0016]更进一步地，所述金纳米粒子粒径为30
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80nm。
[0017]更进一步地，所述加入EDC和NHS反应活化时间为10
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60min，活化温度为室温，加入抗体孵育结合时间为10
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24h，孵育温度为2
‑
8℃。
[0018]更进一步地，所述封闭液成分包括PBS盐溶液、牛血清蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉，保存液成分包括PBS盐溶液、牛血清蛋白、酪蛋白、甘氨酸、脱脂奶粉。
[0019]更进一步地，所述加入封闭液封闭时间为2
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12h，封闭温度为室温。
[0020]优选地，所述步骤S1中免疫拉曼信号金纳米粒子具备拉曼信号表达和新型冠状病毒 SARS
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CoV
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2N蛋白的特异性识别抗体。
[0021]优选地，所述步骤S1中SARS
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CoV
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2病毒N蛋白抗体Ab1为新型冠状病毒N蛋白抗体 SARS
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CoV
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2NP
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mAb。
[0022]优选地，所述步骤S1中拉曼信号分子为近红外吲哚类花菁染料IR808,但不限于此信号分子，其他拉曼分子如尼罗蓝A、吲哚氰绿(ICG)等也在范围内，与金纳米粒子孵育时间为5
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30min。
[0023]优选地，所述步骤S2中生物素化抗体的制备方法为将抗体与生物素混合2
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6h，然后在 PBS溶液里透析15
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将拉曼信号分子和SARS
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CoV
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2病毒N蛋白抗体Ab1分别偶联到金纳米粒子，制备Au@IR808@抗体的免疫拉曼信号金纳米粒子；S2：将生物素与抗体Ab2偶联，制备生物素化抗体Ab2；S3：将步骤S1制得的免疫拉曼信号金纳米粒子与步骤S2制得的生物素化抗体Ab2以及新型冠状病毒N蛋白稀释液混合孵育，再与链霉亲和素化磁珠混合孵育，获得免疫夹心复合物；S4：将步骤S3中的免疫夹心复合物用洗涤液磁吸
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洗涤，并最终浓缩定容至小体积；S5：将S4中的小体积液体滴于表面增强拉曼芯片上进行拉曼检测。2.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：将金纳米粒子与拉曼信号分子搅拌下混合，室温孵育，离心，弃去上层清液，并用缓冲液洗涤一次并定容，加入EDC和NHS溶液反应活化，离心后洗涤，并用缓冲液定容，加入SARS
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CoV
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2病毒N蛋白抗体Ab1，过夜孵育结合，离心，弃去上层清液，加入封闭液孵育，洗涤离心，弃去上层清液，最后重新分散在保存液中，制得免疫拉曼信号金纳米粒子。3.如权利要求2所述的一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲液由硼砂和氢氧化钠配制而成，pH为7.2
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7.6；所述金纳米粒子粒径为30
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80nm。4.如权利要求2所述的一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，其特征在于，所述EDC和NHS反应活化时间为10
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60min，活化温度为室温，孵育结合时间为10
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24h，孵育温度为2
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8℃；所述封闭液成分包括PBS盐溶液、牛血清蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉；所述保存液成分包括PBS盐溶液、牛血清蛋白、酪蛋白、甘氨酸、脱脂奶粉；所述封闭液封闭时间为2
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12h，封闭温度为室温。5.如权利要求1所述的一种基于表面增强拉曼光谱检测新型冠状病毒N蛋白的方法，其特征在于，所述步骤S1中免疫拉曼信号金纳米粒子具备拉曼信号表达和新型冠状病毒SARS
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2N蛋白的特异性识别抗体；所述步骤S1中拉...

【专利技术属性】
技术研发人员：李剑锋，关鹏程，张月皎，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：