寡核苷酸编码的化学文库制造技术

本申请的名称是寡核苷酸编码的化学文库。本申请提供了一种具有共价连接的化合物和共价连接的DNA条形码的珠粒以及使用这种珠粒的方法。所述珠粒具有所述化合物的许多基本上相同的拷贝和所述DNA条形码的许多基本上相同的拷贝。所述化合物由一个或多个化学单体组成，其中所述DNA条形码采取条形码模块的形式，其中每个模块对应于对应的化学单体并允许标识对应的化学单体。所述核酸条形码可以具有级联结构或正交结构。提供了一种用于对珠粒结合的核酸条形码进行测序、用于从珠粒切割化合物以及用于评估所释放化合物的生物学活性的方法。及用于评估所释放化合物的生物学活性的方法。及用于评估所释放化合物的生物学活性的方法。

【技术实现步骤摘要】
寡核苷酸编码的化学文库
[0001]本申请是分案申请，原申请的申请日为2018年9月24日、申请号为2018800720827、专利技术名称为“寡核苷酸编码的化学文库”。


[0002]本公开涉及使用化合物文库的高通量筛选，其中化合物与珠粒结合或包含在珠粒中，每个珠粒含有一种化合物的多个拷贝，其中进一步地珠粒还含有编码包含在珠粒内或上的化合物的身份或合成历史的DNA标签。本公开还涉及在皮可孔中进行的高通量测定，其中皮可孔含有负载化合物的珠粒和测定材料。本公开进一步涉及释放珠粒结合的化合物并对其生物学活性进行筛选。广义地说，本公开设想了将珠粒用作化合物的递送媒剂的测定，以及用于产生这种负载化合物的珠粒的方法。
[0003]本公开涉及珠粒结合的化合物，其中每种化合物由一个或多个属于化学文库的单体制成。本公开还涉及珠粒结合的DNA条形码，即涉及核酸，其中每个核酸的序列是密码(与遗传密码无关)，所述密码是指一种特定的化学文库单体。本公开进一步涉及释放珠粒结合的化合物，然后筛选释放的化合物的生物活性。
[0004]本公开总体上还涉及用于用剂量控制的化合物扰动细胞或几个细胞，并且通过RNA和/或蛋白质分析来分析细胞状态变化的方法。出于高通量筛选、靶标发现或诊断以及其它类似应用的目的，本文公开的方法可以在单细胞水平或多个细胞上应用。
[0005]相关申请的交叉引用
[0006]本申请要求于2017年9月25日提交的美国临时专利申请序号62/562,905和同样于2017年9月25日提交的美国临时专利申请序号62/562,912的权益和优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0007]例如，涉及拆分和合并化学的组合化学可以用于合成大量化合物。以这种方式制得的化合物用于药物化学领域，其中可针对各种生化活性筛选所述化合物。这些活性包含与一种或多种蛋白质的结合，其中在进行筛选测试时蛋白质是已知的。可替代地，仅在检测到结合事件后才标识由被测试的化合物结合的蛋白质。还可以筛选化合物抑制或激活已知蛋白质的活性(这不仅是筛选“结合”活性)。可替代地，可以筛选化合物抑制或激活细胞功能的活性，并且其中在筛选时分子靶标对研究人员来说是未知的。
[0008]通过用成千上万的微孔、纳米孔或皮可孔进行阵列筛选，可以促进化合物的筛选，如属于通过拆分和合并方法制得的庞大化学文库的化合物。此外，可以通过以珠粒的形式向每个皮可孔提供不同的化合物来促进筛选，并且其中每个珠粒含有同一化合物的数百个拷贝，并且其中同一珠粒还含有“DNA条形码”的数百个拷贝，所述DNA条形码可以用于标识连接到同一珠粒的化合物。此外，使用可切割的连接子进一步促进化合物的筛选，其中可切割连接子允许化合物从珠粒中受控释放，并且其中然后将释放的化合物用于同一皮可孔中的生化测定或基于细胞的测定。
[0009]例如，由于所需的测定试剂量少，因此在非常小的限定体积(如液滴、皮可孔或微流体环境)中测定化合物具有广泛的优势，因此不必限于组合产生的化合物。可以将化合物加载到珠粒上，也允许化合物在稍后的时间从珠粒上洗脱下来的任何方法，可以用于将珠粒结合的化合物以较小的受限体积递送到测定中。将核酸条形码添加到珠粒使得能够将存在于珠粒中的化合物的身份携带到测定体积中。以这种方式，无需机器人或微量滴定板内化合物的空间索引即可执行非常高的通量测定。数百万到数十亿种化合物可以保存在一个小瓶中，所述化合物的身份标记在含有每种单独化合物的同一珠粒上(带有DNA)。
[0010]药物发现的常用方法涉及选择感兴趣的靶标并且监测靶蛋白质或酶与大型化合物文库的相互作用。在许多情况下，发现大量初始命中物对身体有毒或与体内其它蛋白质发生交叉反应，这使得基于靶点的选择成为药物筛选的低效方法。对预选靶的需要也是固有的局限性，因为其要求疾病的生物性基础为人所知和理解。针对整个生物体筛选化合物是一项困难、昂贵且通量极低的任务。
[0011]对细胞的常规表型筛选涉及建立患病状态细胞的模型，使细胞与各种药物文库接触，以及监测疾病表型是否通过可测量的测定得到纠正。此类筛选方法被称为表型筛选，因为一开始不一定了解潜在的生物学机制，但是指示治疗反应的可测量的表型变化被视为相关指标。如今，已经有大量反映各种基线和患病细胞状态的细胞系和疾病模型。也可以使用大量的化合物文库和候选生物药物。将不同的细胞模型与不同的候选药物相结合以寻找表型应答的明显筛选活动充满了技术局限性，因为测定仅限于微量滴定板格式和成像方式，这两种方法在通量上均受到严格限制。
[0012]克服通量限制的一种方法是采用高通量单细胞筛选方法进行药物发现(参见例如Heath等人,《自然综述药物发现(Nat Rev Drug Discov.)》15:204
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216,2016)。在这些方法中，将单个细胞分离并分离到可以对每个细胞进行单独测定的隔室中。通过单个细胞的mRNA测序进行基因组分析，例如使用液滴封装，是一种流行的方法，所述方法揭示了集成测量中隐藏的复杂细节(参见，例如Macosko等人,《细胞(Cell)》161:1202
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1214,2015和Ziegenhain等人,《分子细胞(Mol Cell)》65:631
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643,2017，其公开内容通过引用整体并入本文)。当前最先进的单细胞分析平台已使具有单细胞分辨率的mRNA转录物得以定量，从而基于其转录状态表征细胞和对细胞进行指纹采集。这种方法允许比较从受试者提取的或在实验中制备的组织样品之间的差异，并且检查单细胞转录，从而检查蛋白质的表达状态。通过转录组测序和剖析测量单细胞mRNA是重要的方法，不仅是研究疾病进展过程中细胞谱系表型的分子机制，而且是研究药物功效、耐药性和发现治疗靶点的分子机制(参见，例如Chu等人,《细胞生物学与毒理学(Cell Biol and Toxicol)》33:83
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97,2017,Wang,《细胞生物学与毒理学》32:359
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361,2016以及Wang等人,《细胞生物学与毒理学》33:423
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427,2017)。单细胞RNA测序的应用已被用于限定细胞间异质性，由转录组细胞间变异证明，这与药物功效和特异性、转录随机性、转录组可塑性和基因组进化极为相关。还已经证明了皮可孔中的封装(参见例如Gierahn等人,《自然方法(Nat Methods)》14:395
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398,2017)。使用类似的分离方法(Butnik等人,《生物预印本期刊(BioRxiv)》,2017年1月,Su等人,《蛋白质组学(Proteomics)》17:3
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4,2017)也可以进行单细胞蛋白质测量。
[0013]尽管高通量单细胞RNA测序(RNA
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seq)方法(包含如Fluidigm C1、10XGenomics或1CellBiO系统等自动化平台的商业化版本)迅速崛起，但是可以有效地将不同药物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定化合物诱导的细胞中的转录组变化的方法，其中所述化合物包括在组合化学文库的测定，所述方法包括：a)生成测定阵列，其中所述阵列包括：i)多个有限体积，其中每个有限体积与其他有限体积分开，并且其中每个有限体积包括感兴趣的细胞；ii)多个珠粒，其中每个珠粒包括多个基本上相同的化合物，使得每个珠粒包括来自所述组合文库的唯一化合物，并且选择所述文库中的每种化合物作为潜在候选药物；和多个功能化寡核苷酸，其中所述功能化寡核苷酸包括编码所述唯一化合物的结构或用于制造所述唯一化合物的合成步骤的寡核苷酸部分和RNA捕获元件，其中在每个有限体积中分散单个珠粒；b)将每个有限体积中的细胞与从所述珠粒释放到所述有限体积的化合物接触并维持所述接触持续足以响应于所述接触生成所述细胞表达的RNA中的转录组变化的时段；c)通过裂解所述细胞并且将RNA与所述珠粒上的RNA捕获元件接触，捕获在每个有限体积中来自所述细胞的RNA；d)鉴定来自所述多个珠粒的至少一部分的捕获的RNA，并评估所述捕获的RNA中的任何转录组变化；和e)鉴定生成所述转录组变化的任何化合物的结构。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括f)基于与对照相比所述捕获的RNA的水平，评估所述化合物是否证明作为候选药物...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：普莱克斯姆公司，
类型：发明
国别省市：