评估核酸的方法和材料技术

本文提供了用于测序文库制备和测序工作流程(例如，用于鉴定突变)的系统、试剂盒、组合物和方法。在某些实施方式中，本文提供了对两条模板链等同地进行条码化的系统和方法，以及不要求杂交捕获的各链的基于PCR的富集。不要求杂交捕获的各链的基于PCR的富集。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】评估核酸的方法和材料
[0001]本申请要求于2020年2月14日提交的美国临时申请系列号62/977,066的优先权，其全部内容通过引用方式纳入本文。
[0002]关于联邦资金的声明
[0003]本专利技术是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号CA062924、CA152753和CA230691资助完成。政府对本专利技术享有一定的权利。


[0004]本专利技术涉及核苷酸测序领域。具体地，其涉及用于鉴定突变的测序文库制备和测序工作流程。

技术介绍

[0005]罕见突变的鉴定在基础生物学方面以及改善患者的临床管理方面很有用。使用领域包括传染病、免疫组库分析、古遗传学、法医学、衰老、非侵入性产前检测和癌症。下一代测序(NGS)技术在理论上适用于该应用，并且存在用于检测罕见突变的多种NGS方法。然而，对于传统的NGS方法，测序本身的错误率过高，无法可靠地检测突变，尤其是原始样品中低频存在的那些突变。
[0006]分子条形码对原始模板分子加标签的应用旨在克服检测罕见突变的各种障碍。使用分子条形码，对每个带标签分子的PCR产生的后代进行冗余测序，并且容易识别测序错误(Kinde等，Proc Natl Acad Sci U S A 108:9530
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9535(2011))。例如，如果条形码模板分子的后代的给定阈值包含相同的突变，则该突变被认为是真实的(“超突变体”)。如果小于后代的给定阈值包含感兴趣的突变，则该突变被认为是伪影。已经描述了两种类型的分子条形码：外源性和内源性。外源性条形码(本文也称为外源性UID)包含预先指定的或随机的核苷酸，并在文库制备或PCR期间是附加的。内源性条形码(本文也称为内源性UIDS)由待评估的模板DNA的片段(例如，由DNA随机剪切产生的片段或无细胞流体生物样品中存在的片段)的5'和3'端的序列形成。这样的条形码已被证明可用于将扩增子追溯到原始起始模板，从而允许进行分子计数并改进临床相关样品中真实突变的鉴别。
[0007]已经开发了用于双端测序的分叉衔接子以实现“双链体测序”，其中原始DNA双链体的两条链(Watson和Crick)中的每一条都可以通过测序时显示的5'到3'方向性来辨别。双链体测序减少了测序错误，因为如果在文库制备或测序期间错误地产生了相同的突变，则两条DNA链将极不可能包含相同的突变。
[0008]然而，存在许多问题限制了分子条码化的应用范围和临床适用性。例如，将大部分初始模板分子转化为各链上具有相同条形码的双链体分子是一项挑战(Schmitt等,Proc Natl Acad Sci U S A 109:14508
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14513(2012)；Schmitt等,Nat Methods 12:423
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425(2015)；和Newman等,Nat Biotechnol 34:547
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555(2016))。当初始DNA的量有限(例如<33ng)时，这个问题尤其突显，例如在通常用于液体活检物的无细胞血浆DNA中所见那样。
[0009]靶向测序文库的制备通常涉及测序模板的衔接子连接、文库的扩增和杂交捕获以
富集用于感兴趣的靶标的文库。虽然对于富集大的感兴趣区域有效，但杂交捕获无法很好地扩展到小靶区域(Springer等,Elife 7:doi:10.7554/eLife.32143(2018))并且表现出较差的双链体回收(duplex recovery)(Wang等,Proc Natl Acad Sci U S A 112:9704
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9709(2015)；和Wang等,Elife 5:doi:10.7554/eLife.15175(2016))。连续几轮捕获可以部分克服这些限制，但即使有了这样的改进，双链体回收率通常为约1％。CRISPR
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DS可以实现高达15％的回收率，但不适用于无细胞DNA。当靶区域非常小(例如特别感兴趣的基因组中一个或几个位置，例如血浆中疾病监测所需的那样)，或可用的DNA量有限(例如<33ng，通常见于血浆中)，基于捕获的方法是次优的。
[0010]因此，需要改进测序文库制备和工作流程，以能够准确鉴别临床相关样品如液体活检样品中的突变，例如罕见突变。

技术实现思路

[0011]通过提供对两条模板链进行等同条码化的方法，且通过提供一种不需要杂交捕获的基于PCR的富集各链的方法，本文提供了解决这些问题的方法和材料。
[0012]本文涉及可用于检测在双链核酸(例如，DNA)的两条链上是否均存在的一个或多个突变的方法和材料。在一些情况下，用于检测双链核酸的两条链上均存在的一个或多个突变的方法可以包括：生成双链体测序文库，其在该文库的各核酸的各端(例如，5'端和3'端)上具有双链体分子条形码，从双链体测序文库产生单链Watson链衍生序列文库和单链Crick链衍生序列文库，和，在各单链文库中检测双链核酸的两条链上是否均存在一个或多个突变。
[0013]如本文所证明的，对应于双链核酸模板的Watson链的单链DNA文库和对应于双链核酸模板的Crick链的单链DNA文库可以从纳入双链体分子条形码的测序文库中产生，各单链DNA文库可采用链特异性锚定PCR方法对靶区域进行富集，并且靶区域可经测序以检测核酸靶区域内的一个或多个突变的存在与否。例如，本文所述的可用于检测双链核酸的两条链上是否均存在一个或多个突变的方法和材料可称为序列确定无错测序系统(SaferSeqS)，并且可以包括例如这样的文库构建，采用原位生成双链体分子条形码(参见例如图22a)，经锚定PCR的靶标富集(参见例如图22b)，和模板分子的计算机重建(参见例如图22c)。可以通过要求在相同初始核酸分子的两条链上都发现变化来鉴定原始起始模板中存在的真突变(bona fide mutations)。
[0014]能够检测双链核酸的两条链上均存在的一个或多个突变(例如，真正的体细胞突变)提供了以可承受的成本同时准确和有效地评估多个突变的独特且尚未实现的机会。使用本文所述的方法和材料来检测双链核酸的两条链上均存在的一个或多个突变的存在(例如，SaferSeqS方法)可允许以高置信度鉴定罕见突变，同时最小化DNA损伤的量，要进行的PCR的数量，和/或DNA损伤伪影的数量。注意，术语“Watson链”和“Crick链”仅用于区分双链起始核酸序列的两条链。任何一条链都可以表示为“Watson”或“Crick”，然后另一条链用另一个名称表示。
[0015]在一些实施方式中，本文提供的方法包括：a)形成反应混合物，其包含：i)去磷酸化和钝端的多个双链DNA片段，其中各双链DNA片段包含Watson和Crick链；ii)多个衔接子，其中各衔接子在5'到3'方向上包含：A)条形码，和B)通用3'衔接子序列；和iii)连接酶；和
b)孵育反应混合物，从而使本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，所述方法包括：a)a)将部分双链3'衔接子(3'PDSA)连接至分析物DNA样品中双链DNA片段群的Watson和Crick链两者的3'末端，其中3'PDSA的第一链在5'至3'方向上包含(i)第一区段，(ii)外源UID序列，(iii)5'衔接子的退火位点，和(iv)包含R2测序引物位点的通用3'衔接子序列，并且其中3'PDSA的第二链在5'至3'方向上包含(i)与第一区段互补的区段，和(ii)3'封闭基团，b)将5'衔接子退火至所述退火位点，其中5'衔接子在5'至3'方向上包含(i)通用5'衔接子序列，其不与通用3'衔接子序列互补且包含R1测序引物位点，和(ii)与5'衔接子的退火位点互补的序列；c)将5'衔接子延伸贯穿外源UID序列和所述第一区段，由此产生所述外源UID序列的互补序列和所述第一区段的互补序列，和d)将所述第一区段的所述互补序列的3'端共价连接至双链DNA片段的Watson和Crick链的5'端，由此产生多个衔接子连接的双链DNA片段。2.如权利要求1所述的方法，其还包括：用与所述通用3'衔接子序列互补的第一引物和与所述通用5'衔接子互补序列互补的第二引物扩增所述多个衔接子连接的双链DNA片段序列，由此产生扩增子，其中所述扩增子包含多个双链Watson模板和多个双链Crick模板。3.如权利要求2所述的方法，其还包括：用第一组Watson靶标选择性引物对选择性扩增所述双链Watson模板，所述第一组Watson靶标选择性引物对包含：(i)第一Watson靶标选择性引物，其包含与通用3'衔接子序列的部分互补的序列，和(ii)第二Watson靶标选择性引物，其包含靶标选择性序列，由此产生靶标Watson扩增产物。4.如权利要求3所述的方法，其还包括：用第一组Crick靶标选择性引物对选择性地扩增所述双链Crick模板，所述第一组Crick靶标选择性引物对包含：(i)第一Crick靶标选择性引物，其包含与通用5'衔接子序列的部分的互补序列互补的序列，和(ii)第二Crick靶标选择性引物，其包含与第二Watson靶标选择性引物序列相同的靶标选择性序列，由此产生靶标Crick扩增产物。5.如权利要求1所述的方法，其还包括：去除所述3'PDSA的所述第二链以产生单链3'衔接子(3'SSA)。6.如权利要求5所述的方法，其中所述去除所述第二链发生在步骤b)之后，或步骤b)之前，或步骤b)期间。7.如权利要求5所述的方法，其中所述第二链包含一个或多个脱氧尿苷，并且其中所述去除所述3'PDSA的所述第二链包括使3'双链体衔接子与尿嘧啶
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DNA糖基化酶(UDG)接触以降解所述第二链。8.如权利要求5所述的方法，其中所述去除所述第二链通过具有核酸外切酶活性的聚合酶完成，其中所述聚合酶将所述5'衔接子延伸贯穿外源性UID序列和所述第一区段。9.如权利要求2所述的方法，其还包括：确定一个或多个所述扩增子的序列读数。10.如权利要求9所述的方法，其还包括：将序列读取分配到UID家族，其中UID家族的各成员包含相同的外源性UID序列。11.如权利要求10所述的方法，其还包括：根据外源性UID序列与R1和R2读数序列的空
间关系，将各UID家族的序列读数分配到Watson亚家族和Crick亚家族。12.如权利要求11所述的方法，其还包括：当至少50％的Watson亚家族包含某一核苷酸序列时，将该序列鉴定为准确代表分析物DNA片段的Watson链。13.如权利要求12所述的方法，其还包括：当至少50％的Crick亚家族包含某一核苷酸序列时，将该序列鉴定为准确代表分析物DNA片段的Crick链。14.如权利要求12所述的方法，其还包括：当准确代表Watson链的核苷酸序列与缺乏突变的参考序列不同时，鉴定该准确代表Watson链的序列中的突变。15.如权利要求14所述的方法，其还包括：当准确代表Crick链的核苷酸序列与缺乏突变的参考序列不同时，鉴定该准确代表Crick链的序列中的突变。16.如权利要求15所述的方法，其还包括：当准确代表Watson链的核苷酸序列中的突变和准确代表Crick链的核苷酸序列中的突变为相同突变时，鉴定分析物DNA片段中的突变。17.如权利要求10所述的方法，其中UID家族的各成员还包含相同的内源性UID序列，其中所述内源性UID序列包含来自群的双链DNA片段的末端。18.如权利要求1所述的方法，其中，所述双链DNA片段群具有钝端。19.一种系统，其包括：a)部分双链3'衔接子(3'PDSA)群，其被设置为连接至双链DNA片段群的Watson和Crick链两者的3'端，其中3'PDSA的第一链在5'至3'方向上包含(i)第一区段，(ii)外源UID序列，(iii)5'衔接子的退火位点，和(iv)包含R2测序引物位点的通用3'衔接子序列，并且其中3'PDSA的第二链在5'至3'方向上包含(i)与第一区段互补的区段，和(ii)3'封闭基团；和b)设置为退火至所述退火位点的5'衔接子群，其中5'衔接子在5'到3'方向上包含(i)通用5'衔接子序列，其不与通用3'衔接子序列互补且包含R1测序引物位点，和(ii)与3'衔接子的退火位点互补的序列。20.如权利要求19所述的系统，还包括：c)来自生物样品的所述双链DNA片段群。21.如权利要求20所述的系统，其中，所述双链DNA片段群具有钝端。22.如权利要求19所述的系统，还包括：c)用于降解所述3'PDSA的所述第二链以产生单链3'衔接子(3'SSA)的试剂。23.如权利要求19所述的系统，还包括：c)与所述通用3'衔接子序列互补的第一引物，和与所述通用5'衔接子序列的互补序列互补的第二引物。24.如权利要求19所述的系统，还包括：c)与所述通用3'衔接子序列互补的Watson锚定引物，和d)与所述通用5'衔接子序列互补的Crick锚定引物。25.如权利要求19所述的系统，还包括：c)第一组Watson靶标选择性引物对，所述引物对包含(i)一个或多个第一Watson靶标选择性引物，其包含与通用3'衔接子序列的部分互补的序列，和(ii)一个或多个第二Watson靶标选择性引物，所述一个或多个第二Watson靶标选择性引物各自包含靶标选择性序列，和d)第一组Crick靶标选择性引物对，所述引物对包含(i)一个或多个Crick靶标选择性引物，其包含与通用5'衔接子序列的部分的互补序列互补的序列，和(ii)一个或多个第二
Crick靶标选择性引物，所述一种或多种第二Crick靶标选择性引物各自包含与第二Watson靶标选择性引物序列相同的靶标选择性序列。26.一种方法，其包括：a)形成反应混合物，其包含：i)去磷酸化和钝端的多个双链DNA片段，其中各所述双链DNA片段包含Watson和Crick链；ii)多个衔接子，其中各所述衔接子在5'到3'方向上包含：A)条形码，和B)通用3'衔接子序列；和iii)连接酶；和b)孵育所述反应混合物，从而使得：i)衔接子被连接至Watson和Crick链的3'端，并且ii)衔接子不被连接至Watson或Crick链的5'端，由此产生双链连接产物。27.如权利要求26所述的方法，其中，所述多个衔接子各自包含独特条形码。28.如权利要求27所述的方法，其中所述双链连接产物各自包含具有仅一个条形码的Watson链和具有与所述Watson链上的所述条形码不同的仅一个条形码的Crick链。29.一种用于检测从哺乳动物样品获得的双链DNA模板的靶区域中突变存在与否，以及确定该突变是否均存在于双链DNA模板的两条链上的方法，其中所述方法包括：A)产生双链DNA片段，其各自在双链DNA片段的各端具有双链体分子条形码；B)扩增在双链DNA片段的各端包含双链体分子条形码的双链DNA片段以产生扩增的双链体测序文库，其中所述扩增包括在全基因组PCR条件下，使在双链DNA片段各端上包含双链体分子条形码的双链DNA片段与通用引物对接触；C)任选地，从扩增的双链体测序文库生成Watson链的单链DNA文库；D)任选地，从扩增的双链体测序文库中产生Crick链的单链DNA文库；E)使用包含能够与靶区域杂交的第一引物和能够与3'双链体衔接子杂交的第二引物的引物对，扩增Watson链的DNA文库的靶区域；F)使用包含能够与靶区域杂交的第一引物和能够与5'衔接子杂交的第二引物的引物对，扩增Crick链的DNA文库的靶区域；G)对从Watson链的DNA文库扩增的靶区域进行测序，以产生测序读数并检测靶区域的Watson链中突变的存在与否；H)对从Crick链的DNA文库扩增的靶区域进行测序，以产生测序读数并检测靶区域的Crick链中突变的存在与否；I)通过各测序读数中存在的分子条形码对测序读数进行分组，以确定突变是否均存在于双链DNA模板的两条链上。30.如权利要求29所述的方法，其中产生在所述双链DNA片段的各端均具有双链体分子条形码的双链DNA片段包括：i)将3'双链体衔接子连接至由双链DNA模板获得的双链DNA片段的各3'端，其中3'双链体衔接子包含a)含有5'磷酸的第一寡核苷酸，第一分子条形码，和退火至b)包含可降解3'封闭基团的第二寡核苷酸的3'寡核苷酸，其中3'寡核苷酸和第二寡核苷酸序列互补；ii)降解可降解的3'封闭基团；iii)将5'衔接子连接至由双链DNA模板获得的双链DNA片段的各去磷酸化5'端，其中5'
双链体衔接子包含含有第二分子条形码的寡核苷酸，其中第二分子条形码不同于第一分子条形码，其中5'衔接子连接在第一分子条形码上游的双链DNA片段上，并在双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间留下单链核酸的缺口；和iv)填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的单链核酸的缺口，以产生在双链DNA片段的各端包含双链分子条形码的双链DNA片段。31.如权利要求29所述的方法，其中从扩增的双链体测序文库产生Watson链的DNA文库包括：i)使用由第一引物和第二引物组成的引物对扩增扩增的双链体测序文库的第一等分部分，其中第一引物能够与Watson链杂交，并且其中第一引物包含标签，以产生具有带标签Watson链的双链扩增产物；ii)使具有带标签Watson链的双链扩增产物变性，以产生单链带标签Watson链和单链Crick链；和iii)回收单链带标签Watson链，以从扩增的双链体测序文库产生Watson链的DNA文库。32.如权利要求29
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31中任一项所述的方法，其中所述双链DNA模板由来自哺乳动物的样品获得，从扩增的双链体测序文库产生Crick链的DNA文库包括：i)使用包含第一引物和第二引物的引物对扩增扩增的双链体测序文库的第二等分部分，其中第一引物能够与Crick链杂交，并且其中第一引物包含标签，以产生具有带标签Crick链的双链扩增产物；ii)使具有带标签Crick链的双链扩增产物变性，以产生单链带标签Crick链和单链Watson链；和iii)回收单链带标签Crick链，以从扩增的双链体测序文库产生Crick链的DNA文库。33.如权利要求29
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32中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。34.如权利要求29
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33中任一项所述的方法，其中所述方法还包括，在产生在双链DNA片段的各端具有双链分子条形码的双链DNA片段之前：使双链DNA片段化以产生双链DNA片段；使双链DNA片段的5'端去磷酸化；和使双链DNA片段的末端钝化。35.如权利要求29
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34中任一项所述的方法，其中将3'双链体衔接子连接至从双链DNA模板获得的双链DNA片段的各3'端包括：在连接酶的存在下，使3'双链体衔接子和从双链DNA模板获得的双链DNA片段接触。36.如权利要求35所述的方法，其中所述连接酶是T4 DNA连接酶。37.如权利要求29
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36中任一项所述的方法，其中所述降解可降解的3'封闭基团包括使3'双链体衔接子与尿嘧啶
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DNA糖基化酶(UDG)接触。38.如权利要求29
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37中任一项所述的方法，其中将5'衔接子连接至从双链DNA模板获得的双链DNA片段的各去磷酸化的5'端包括，在连接酶存在下，使所述5'衔接子和从双链DNA模板获得的所述双链DNA片段接触。39.如权利要求38所述的方法，其中所述连接酶是大肠杆菌连接酶。40.如权利要求29
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39中任一项所述的方法，其中填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的单链核酸缺口包括：在聚合酶和dNTP的存在下，使双链DNA片段的5'端和5'衔接子接
触。41.如权利要求40所述的方法，其中所述聚合酶是Taq聚合酶。42.如权利要求29
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31中任一项所述的方法，其中将5'衔接子连接至双链DNA片段的各5'端和填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的缺口同时进行。43.如权利要求29
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42中任一项所述的方法，其中扩增在双链DNA片段各端包含双链体分子条形码的双链DNA片段以产生扩增的双链体测序文库包括：在PCR条件下，使在双链DNA片段各端包含双链体分子条形码的双链DNA片段与通用引物对接触。44.如权利要求43所述的方法，其中所述扩增包括全基因组PCR。45.如权利要求29
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44中任一项所述的方法，其中带标签引物是生物素化的引物，并且其中所述生物素化的引物能够产生生物素化的单链Watson链和生物素化的单链Crick链。46.如权利要求45所述的方法，其中所述变性步骤包括：NaOH变性、热变性或两者的组合。47.如权利要求45或46所述的方法，其中回收步骤包括使带标签Watson链与链霉亲和素功能化珠接触并且使带标签Crick链与链霉亲和素功能化珠接触。48.如权利要求47所述的方法，其中回收步骤还包括使未带标签Watson链变性和使未带标签Watson链变性。49.如权利要求47或48所述的方法，其中回收步骤还包括从链霉亲和素功能化珠释放生物素化单链Watson链和从链霉亲和素功能化珠释放生物素化单链Crick链。50.如权利要求29
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44中任一项所述的方法，其中带标签引物是磷酸化的引物，并且其中所述磷酸化的引物可以产生磷酸化单链Watson链和磷酸化单链Crick链。51.如权利要求50所述的方法，其中所述变性步骤包括λ核酸外切酶消化。52.如权利要求29
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51中任一项所述的方法，其中从Watson链的DNA文库扩增靶区域还包括使用第二引物对进行第二扩增，所述第二引物对包括：能够与所述靶区域杂交的第一引物和能够与3'双链体衔接子杂交的第二引物；并且其中从Crick链的DNA文库扩增靶区域还包括使用第二引物对进行第二扩增，所述第二引物对包括能够与靶区域杂交的第一引物和能够与5'衔接子杂交的第二引物。53.如权利要求29
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52中任一项所述的方法，其中所述测序步骤包括双端测序。54.一种用于检测从哺乳动物样品获得的双链DNA模板的靶区域中突变存在与否，以及确定该突变是否均存在于双链DNA模板的两条链上的方法，其中所述方法包括：A)产生双链DNA片段，其各自在双链DNA片段的各端具有双链体分子条形码；B)从来自在双链DNA片段的各端具有双链分子条形码的双链DNA片段的扩增双链体测序文库产生Watson链的DNA文库和Crick链的DNA文库；C)使用由能够与靶区域杂交的第一引物和能够与3'双链体衔接子杂交的第二引物组成的引物对，扩增来自单链Watson链的靶区域；D)使用由能够与靶区域杂交的第一引物和能够与5'衔接子杂交的第二引物组成的引物对，扩增来自单链Crick链的靶区域；E)对从Watson链的DNA文库扩增的靶区域进行测序，以产生测序读数并检测靶区域的Watson链中突变的存在与否；F)对从Crick链的DNA文库扩增的靶区域进行测序，以产生测序读数并检测靶区域的
Crick链中突变的存在与否；G)通过各测序读数中存在的分子条形码对测序读数进行分组，以确定突变是否均存在于双链DNA模板的两条链上。55.如权利要求54所述的方法，其中所述双链DNA模板是基因组DNA样品并且产生在双链DNA片段的各端均具有双链体分子条形码的双链DNA片段包括：i)将3'双链体衔接子连接至由双链DNA模板获得的双链DNA片段的各3'端，其中3'双链体衔接子包含a)含有5'磷酸的第一寡核苷酸，第一分子条形码，和退火至b)包含可降解3'封闭基团的第二寡核苷酸的3'寡核苷酸，其中3'寡核苷酸和第二寡核苷酸序列互补；ii)降解可降解的3'封闭基团；iii)将5'衔接子连接至由双链DNA模板获得的双链DNA片段的各去磷酸化5'端，其中5'双链体衔接子包含含有第二分子条形码的寡核苷酸，其中第二分子条形码不同于第一分子条形码，其中5'衔接子连接在第一分子条形码上游的双链DNA片段上，并在双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间留下单链核酸的缺口；和iv)填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的单链核酸的缺口，以产生在双链DNA片段的各端包含双链体分子条形码的双链DNA片段。56.如权利要求54所述的方法，其中所述双链DNA模板是无细胞DNA样品，并且从来自在双链DNA片段各端均具有双链体分子条形码的双链DNA片段的扩增的双链体测序文库产生Watson链的DNA文库和Crick链的DNA文库包括：i)使用由第一引物和第二引物组成的通用引物对扩增在双链DNA片段的各端具有双链体分子条形码的双链DNA片段，其中所述扩增包括，在全基因组PCR条件下，使在双链DNA片段的各端均包含双链体分子条形码的双链DNA片段与所述引物对接触，其中第一引物能够与Watson链杂交，并且其中第一引物被生物素化，以产生具有生物素化的Watson链的双链扩增产物；ii)在生物素化的Watson链与链霉亲和素功能化珠结合的条件下，使具有生物素化的Watson链的双链扩增产物与链霉亲和素功能化珠接触；iii)使具有生物素化Watson链的双链扩增产物变性，以使单链生物素化Watson链与链霉亲和素功能化珠保持结合并释放单链Crick链；iv)收集单链Crick链；v)从链霉亲和素功能化珠释放单链生物素化Watson链；和vi)收集单链生物素化Watson链。57.如权利要求54
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56中任一项所述的方法，其中双链DNA模板获自哺乳动物的样品。58.如权利要求54
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57中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。59.如权利要求54
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58中任一项所述的方法，其中所述方法还包括，在产生在双链DNA片段的各端具有双链体分子条形码的双链DNA片段之前：使双链DNA片段化以产生双链DNA片段；使双链DNA片段的5'端去磷酸化；和使双链DNA片段的末端钝化。60.如权利要求54
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59中任一项所述的方法，其中将3'双链体衔接子连接至从双链DNA模板获得的双链DNA片段的各3'端包括：在连接酶的存在下，使3'双链体衔接子和从双链
DNA模板获得的双链DNA片段接触。61.如权利要求60所述的方法，其中所述连接酶是T4 DNA连接酶。62.如权利要求54
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61中任一项所述的方法，其中所述降解可降解的3'封闭基团包括使3'双链体衔接子与尿嘧啶
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DNA糖基化酶(UDG)接触。63.如权利要求54
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62中任一项所述的方法，其中将5'衔接子连接至从双链DNA模板获得的双链DNA片段的各去磷酸化的5'端包括，在连接酶存在下，使所述5'衔接子和从双链DNA模板获得的所述双链DNA片段接触。64.如权利要求63所述的方法，其中所述连接酶是大肠杆菌连接酶。65.如权利要求54
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64中任一项所述的方法，其中填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的单链核酸缺口包括：在聚合酶和dNTP的存在下，使双链DNA片段的5'端和5'衔接子接触。66.如权利要求65所述的方法，其中所述聚合酶是Taq
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B聚合酶。67.如权利要求54
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66中任一项所述的方法，其中将5'衔接子连接至双链DNA片段的各5'端和填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的缺口同时进行。68.如权利要求54
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67中任一项所述的方法，其中扩增在双链DNA片段的各端具有双链体分子条形码的双链DNA片段包括：在PCR条件下，使在双链DNA片段的各端包含双链体分子条形码的双链DNA片段与所述引物对接触。69.如权利要求68所述的方法，其中扩增包括全基因组PCR。70.如权利要求54
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69中任一项所述的方法，其中从Watson链的DNA文库扩增靶区域还包括使用第二引物对进行第二扩增，所述第二引物对包括：能够与所述靶区域杂交的第一引物和能够与3'双链体衔接子杂交的第二引物；并且其中从Crick链的DNA文库扩增靶区域还包括使用第二引物对进行第二扩增，所述第二引物对包括能够与靶区域杂交的第一引物和能够与5'衔接子杂交的第二引物。71.如权利要求54
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70中任一项所述的方法，其中所述测序步骤包括双端测序或单端测序。72.一种用于检测从哺乳动物样品获得的双链DNA模板的靶区域中突变存在与否，以及确定该突变是否均存在于双链DNA模板的两条链上的方法，其中所述方法包括：A)产生双链DNA片段，其各自在双链DNA片段的各端具有双链体分子条形码；B)使用通用引物对扩增在双链DNA片段的各端均具有双链体分子条形码的双链DNA片段，其中所述扩增包括：在全基因组PCR条件下，使在双链DNA片段的各端包含双链体分子条形码的双链DNA片段接触所述引物对；C)使用由能够与靶区域杂交的第一引物和能够与3'双链体衔接子杂交的第二引物组成的引物对，扩增来自各自在双链DNA片段的各端上具有双链体分子条形码的扩增的双链DNA片段的Watson链的靶区域；D)使用由能够与靶区域杂交的第一引物和能够与5'衔接子杂交的第二引物组成的引物对，扩增来自各自在双链DNA片段的各端上具有双链体分子条形码的扩增的双链DNA片段的Crick链的靶区域；E)对从Watson链扩增的靶区域进行测序，以产生测序读数并检测靶区域的Watson链中突变的存在与否；
F)对从Crick链扩增的靶区域进行测序，以产生测序读数并检测靶区域的Crick链中突变的存在与否；G)通过各测序读数中存在的分子条形码对测序读数进行分组，以确定突变是否均存在于双链DNA模板的两条链上。73.如权利要求72所述的方法，其中所述双链DNA模板是基因组DNA样品并且产生在双链DNA片段的各端均具有双链分子条形码的双链DNA片段包括：i)将3'双链体衔接子连接至由双链DNA模板获得的双链DNA片段的各3'端，其中3'双链体衔接子包含a)含有5'磷酸的第一寡核苷酸，第一分子条形码，和退火至b)包含可降解3'封闭基团的第二寡核苷酸的3'寡核苷酸，其中3'寡核苷酸和第二寡核苷酸序列互补；ii)降解可降解的3'封闭基团；iii)将5'衔接子连接至由双链DNA模板获得的双链DNA片段的各去磷酸化5'端，其中5'双链体衔接子包含含有第二分子条形码的寡核苷酸，其中第二分子条形码不同于第一分子条形码，其中5'衔接子连接在第一分子条形码上游的双链DNA片段上，并在双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间留下单链核酸的缺口；和iv)填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的单链核酸的缺口，以产生在双链DNA片段的各端包含双链分子条形码的双链DNA片段。74.如权利要求73所述的方法，其中双链DNA模板是无细胞DNA样品。75.如权利要求72
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74中任一项所述的方法，其中双链DNA模板是基因组DNA样品。76.如权利要求72
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75中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。77.如权利要求72
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76中任一项所述的方法，其中所述方法还包括，在产生在双链DNA片段的各端具有双链分子条形码的双链DNA片段之前：使双链DNA片段化以产生双链DNA片段；使双链DNA片段的5'端去磷酸化；和使双链DNA片段的末端钝化。78.如权利要求72
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77中任一项所述的方法，其中将3'双链体衔接子连接至从双链DNA模板获得的双链DNA片段的各3'端包括：在连接酶的存在下，使3'双链体衔接子和从双链DNA模板获得的双链DNA片段接触。79.如权利要求50所述的方法，其中所述连接酶是T4 DNA连接酶。80.如权利要求72
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79中任一项所述的方法，其中所述降解可降解的3'封闭基团包括使3'双链体衔接子与尿嘧啶
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DNA糖基化酶(UDG)接触。81.如权利要求72
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80中任一项所述的方法，其中将5'衔接子连接至从双链DNA模板获得的双链DNA片段的各去磷酸化的5'端包括，在连接酶存在下，使所述5'衔接子和从双链DNA模板获得的所述双链DNA片段接触。82.如权利要求81所述的方法，其中所述连接酶是大肠杆菌连接酶。83.如权利要求72
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82中任一项所述的方法，其中填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的单链核酸缺口包括：在DNA聚合酶和dNTP的存在下，使双链DNA片段的5'端和5'衔接子接触。84.如权利要求83所述的方法，其中所述DNA聚合酶是Taq
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B聚合酶。85.如权利要求72
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84中任一项所述的方法，其中将5'衔接子连接至双链DNA片段的各
5'端和填充双链DNA片段的5'端和5'衔接子之间的缺口同时进行。86.如权利要求72
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85中任一项所述的方法，其中扩增在双链DNA片段的各端具有双链体分子条形码的双链DNA片段包括：在PCR条件下，使在双链DNA片段的各端包含双链体分子条形码的双链DNA片段与所述引物对接触。87.如权利要求86所述的方法，其中所述扩增包括全基因组PCR。88.如权利要求72
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87中任一项所述的方法，其中从Watson链的DNA文库扩增靶区域还包括使用第二引物对进行第二扩增，所述第二引物对包括：能够与所述靶区域杂交的第一引物和能够与3'双链体衔接子杂交的第二引物；并且其中从Crick链的DNA文库扩增靶区域还包括使用第二引物对进行第二扩增，所述第二引物对包括能够与靶区域杂交的第一引物和能够与5'衔接子杂交的第二引物。89.如权利要求72
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88中任一项所述的方法，其中所述测序步骤包括双端测序。90.一种方法，其包括：a.使部分双链3'衔接子连接至分析物DNA样品中双链DNA片段群的Watson和Crick链两者的3'端，其中部分双链3'衔接子的第一链在5'至3'方向上包含，(i)第一段，(ii)外源性UID序列，(iii)5'衔接子的退火位点，和(iv)通用3'衔接子序列，其包含R2测序引物位点，并且其中所述部分双链3'衔接子的第二链在5'至3'方向上包含(i)与第一区段互补的区段，和(ii)3'封闭基团，任选地其中所述第二链可降解；b.通过退火位点使5'衔接子退火至3'衔接子，其中5'衔接子在5'到3'方向上包含：(i)通用5'衔接子序列，其不与通用3'衔接子序列互补，并且包含R1测序引物位点，和(ii)与5'衔接子的退火位点互补的序列；c.进行切口平移样反应以使5'衔接子延伸贯穿3'衔接子的外源性UID序列，并将延伸的5'衔接子共价连接至双链DNA片段的Watson和Crick链的5'端；d.进行初始扩增，以扩增衔接子连接的双链DNA片段，以产生扩增子；e.确定一个或多个衔接子连接的双链DNA片段的一个或多个扩增子的序列读数；f.将序列读取分配到UID家族，其中UID家族的各成员包含相同的外源性UID序列；g.根据外源性UID序列与R1和R2读数序列的空间关系，将各UID家族的序列读数分配到Watson亚家族和Crick亚家族；h.当阈值百分数的Watson亚家族成员包含某一核苷酸序列时，将该序列鉴定为准确代表分析物DNA片段的Watson链；h.当阈值百分数的Crick亚家族成员包含某一核苷酸序列时，将该序列鉴定为准确代表分析物DNA片段的Crick链；j.当准确代表Watson链的核苷酸序列与缺乏突变的参考序列不同时，鉴定该准确代表Watson链的序列中的突变；k.当准确代表Crick链的核苷酸序列与缺乏突变的参考序列不同时，鉴定该准确代表Crick链的序列中的突变；和l.当准确代表Watson链的核苷酸序列中的突变和准确代表Crick链的核苷酸序列中的突变为相同突变时，鉴定分析物DNA片段中的突变。91.如权利要求90所述的方法，其中UID家族的各成员还包含相同的内源性UID序列，其中所述内源性UID序列包含来自群的双链DNA片段的末端。
92.如权利要求91所述的方法，其中包含双链DNA片段的末端的内源性UID序列包含至少8、10或15个碱基。93.如权利要求90
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92中任一项所述的方法，其中所述外源性UID序列对于各双链DNA片段是独特的。94.如权利要求90
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【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：约翰斯霍普金斯大学，
类型：发明
国别省市：