性能增强的蛋白酶变体VII制造技术

本发明专利技术涉及包含氨基酸序列的蛋白酶，所述氨基酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:1所列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情况下基于根据SEQ ID NO:1的编号具有：(a)在对应于位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处的氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271E；和(b)在对应于位置89、131和189的至少一个位置处的至少一个其它氨基酸取代。本发明专利技术还涉及所述蛋白酶的制备和用途。这种蛋白酶表现出非常好的清洁性能。性能。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】性能增强的蛋白酶变体VII
[0001]本专利技术属于酶
本专利技术涉及来自短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)的蛋白酶，其氨基酸序列已被改变以赋予它们更好的清洁性能，特别是关于在洗涤剂和清洁剂中的用途，并且还涉及编码所述蛋白酶的核酸及其制备。本专利技术还涉及这些蛋白酶的用途和使用它们的方法，以及含有它们的试剂，特别是洗涤剂和清洁剂。
[0002]蛋白酶是一些工业上最重要的酶。对于洗涤剂和清洁剂，它们是建立时间最长的酶，并且几乎包含在所有现代、有效的洗涤剂和清洁剂中。它们使待清洁的物品上的含蛋白质的污渍降解。这些之中，枯草杆菌蛋白酶型的蛋白酶(枯草杆菌酶、枯草杆菌肽酶、EC 3.4.21.62)又是特别重要的，并且由于催化活性氨基酸而是丝氨酸蛋白酶。它们起非特异性内肽酶的作用，并水解位于肽或蛋白质内部的任何酰胺键。它们的最佳pH值通常在明显的碱性范围内。例如，"Subtilisin enzymes"中第75
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95页的R.Siezen的文章"Subtilases：Subtilisin
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like Proteases"，R.Bott和C.Betzel编辑，New York，1996提供了该家族的综述。枯草杆菌酶是由微生物天然形成的。特别是，由芽孢杆菌(Bacillus)物种形成和分泌的枯草杆菌蛋白酶是枯草杆菌酶中最重要的一类。
[0003]在洗涤剂和清洁剂中优选使用的枯草杆菌蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶BPN'和Carlsberg、蛋白酶PB92、枯草杆菌蛋白酶147和309、来自迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的蛋白酶、特别是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶DY和嗜热蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶TW3和TW7，这些可归类为枯草杆菌蛋白酶，但不再是狭义的枯草杆菌蛋白酶，以及氨基酸序列相对于起始蛋白酶已改变的所述蛋白酶的变体。蛋白酶通过现有技术已知的方法有选择地或随机地改变，并因此优化用于例如洗涤剂和清洁剂中。这些方法包括点诱变、缺失或插入诱变或与其它蛋白质或蛋白质部分融合。因此，对于现有技术中已知的大多数蛋白酶，适当优化的变体是已知的。
[0004]例如，欧洲专利申请EP 2016175 A1公开了一种来自短小芽胞杆菌的蛋白酶，用于洗涤剂和清洁剂。通常，在任何情况下，只有选定的蛋白酶适合用于含表面活性剂的液体制剂中。许多蛋白酶在这种制剂中不显示出足够的催化性能。因此，对于在清洁剂中使用蛋白酶，它们在洗涤循环期间的条件下具有高催化活性和高储存稳定性是特别期望的。
[0005]因此，现有技术的含蛋白酶和表面活性剂的液体配制剂具有以下缺点：所含的蛋白酶在标准洗涤条件下(例如，在20℃至40℃的温度范围内)不具有令人满意的蛋白水解活性或是储存不稳定性的，因此该配制剂对蛋白酶敏感的污渍不显示出最佳的清洁性能。
[0006]令人惊讶地，现已发现，与野生型形式和/或参照突变体相比，来自短小芽胞杆菌的蛋白酶或充分相似的蛋白酶(基于序列同一性)，其基于根据SEQ ID NO:1的编号在对应于位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处具有氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271E，以及在对应于位置89、131和189的位置的至少一个处、优选至少两个处具有至少一个其它氨基酸取代，任选选自89A/G、131H/Y/F和189T/L/I，在清洁性能方面得到改进，因此特别适合用于洗涤剂或清洁剂中。
[0007]在第一方面，本专利技术因此涉及包含氨基酸序列的蛋白酶，所述氨基酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:1所列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情
况下基于根据SEQ ID NO:1的编号具有：
[0008](a)在对应于位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271E；以及
[0009](b)在对应于位置89、131和189的位置的至少一个、优选至少两个处的至少一个其它氨基酸取代，特别是选自89A/G、131H/Y/F和189T/L/I，更优选选自89A、131H和189T。
[0010]本专利技术还涉及制备如上定义的蛋白酶的方法，所述蛋白酶包括在起始蛋白酶的氨基酸取代，所述起始蛋白酶在其整个长度上与SEQ ID NO:1所列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，所述氨基酸取代(i)在对应于SEQ ID NO:1中位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处，使得所述蛋白酶在所述位置处包含氨基酸取代、特别是氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271E，和(ii)在对应于SEQ ID NO:1中的位置89、131和189的位置的至少一个、优选至少两个处，具有至少一个其它氨基酸取代，特别是选自89A/G、131H/Y/F和189T/L/I，更优选选自89A、131H和189T。通过该方法可以获得的蛋白酶在其整个长度上与SEQ ID NO:1所列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。
[0011]因此，在本专利申请的意义上的蛋白酶既包括蛋白酶本身，也包括通过根据本专利技术的方法制备的蛋白酶。因此，所有关于蛋白酶的陈述都涉及蛋白酶本身以及通过相应的方法制备的蛋白酶。
[0012]本专利技术的其它方面涉及编码这些蛋白酶的核酸、涉及含有根据本专利技术的蛋白酶或核酸的非人类宿主细胞，以及涉及包含根据本专利技术的蛋白酶的试剂，特别是洗涤剂和清洁剂，涉及洗涤和清洁方法，以及涉及根据本专利技术的蛋白酶在洗涤剂或清洁剂中用于去除含蛋白质的污渍的用途。
[0013]本文使用的"至少一种"表示一种或多种，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多。
[0014]本专利技术基于专利技术人令人惊讶的发现，即在本文描述的位置处的氨基酸取代导致该改变的蛋白酶在洗涤剂和清洁剂中改进的清洁效果。
[0015]在根据本专利技术的蛋白酶的优选实施方式中，所述蛋白酶在对应于位置89、131和189的位置处具有选自氨基酸取代89A、89G、131H、131Y、131F、189L、189I和189T的取代。特别优选的是89A、131H和189T。在各种实施方式中，所述蛋白酶在这些位置的至少两个处具有相应取代。这两个取代可以优选是在下述位置处的那些：(i)89和189，(ii)131和189或(iii)89和131，以及任选地在所有三个位置89、131和189中所有取代。这些优选是89A、131H和189T。
[0016]在各种实施方式中，所述蛋白酶具有
[0017](1)在对应于位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含氨基酸序列的蛋白酶，所述氨基酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:1所列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情况下基于根据SEQ ID NO:1的编号具有：(a)在对应于位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处的氨基酸取代，优选氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271E；以及(b)在对应于位置89、131和189的位置的至少一个、优选至少两个处的至少一个其它氨基酸取代，优选选自89A/G、131H/Y/F和189T/L/I。2.根据权利要求1所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有(1)在对应于位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处的氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271E；和(2)在对应于位置89、131和189的至少两个位置处的，选自89A、89G、131H、131Y、131F、189T、189L和189I，优选89A、131H和189T的氨基酸取代。3.根据权利要求1
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2之一所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶具有(1)在对应于位置9、130、133、144、217、224、252和271的位置处的氨基酸取代，特别是氨基酸取代9T、130D/V、133A、144K、217M、224A、252T和271E；和(2)在对应于下述位置的位置处(a)131和189，氨基酸取代131H和189T；(b)89和131，氨基酸取代89A和131H；(c)89和189，氨基酸取代89A和189T；或(d)89、131和189，氨基酸取代89A、131H和189T。4.根据权利要求3所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶在对应于位置9、130、133、144、217、252和271的位置处具有氨基酸取代9T、130D、133A、144K、217M、252T和271E，以及，在对应于下述位置的位置处具有(a)131和189，氨基酸取代131H和189T；(b)89和131，氨基酸取代89A和131H；(c)89和189，氨基酸取代89A和189T；或(d)89、131和189，氨基酸取代89A、131H和189T。5.根据权利要求3所述的蛋白酶，其中所述蛋白酶在对应于位置...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：汉高股份有限及两合公司，
类型：发明
国别省市：