GPI诱导的胰岛素靶向型外泌体的制备及其在递送重组生物药物中的应用制造技术

本发明专利技术为GPI诱导的胰岛素靶向型外泌体的制备及其在递送重组生物药物中的应用。包括pMCP

【技术实现步骤摘要】
GPI诱导的胰岛素靶向型外泌体的制备及其在递送重组生物药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种能使靶向分子表达于外泌体表面从而增强外泌体靶向能力的质粒的构建，以及一种恢复线粒体功能的高表达sirt2蛋白的重组质粒的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]线粒体(mitochondrion)是一种存在于大多数细胞中的双层膜包被的细胞器，是细胞中负责制造能量的结构，也是细胞进行有氧呼吸的主要场所。线粒体功能障碍(Mitochondrial dysfunction)指的是因为线粒体膜遭到破坏、线粒体DNA(mtDNA)损伤、呼吸链受到抑制等引起的能量代谢障碍，而线粒体功能障碍会造成线粒体膜电位降低，呼吸链酶活性下降，氧化应激增加，ATP合成减少，而mtDNA氧化损伤更是会进一步导致线粒体的生物合成能力降低，从而加重线粒体功能障碍，最后使得细胞凋亡。线粒体功能障碍的特点主要是电子呼吸链效率的丧失以及ATP合成的减少，这也是衰老及慢性疾病的主要特征。
[0003]SIRT2(Sirtuin2)基因是sirtuin蛋白家族的成员，与酵母Sir2蛋白同源。与其相关的信号通路有DNA损伤、DSBs修复机制和p53信号转导机制。与该基因相关的基因本体(GO)注释包括染色质结合和组蛋白去乙酰化酶结合。NAD依赖型脱乙酰酶2(NAD
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dependent deacetylase sirtuin 2,sirtuin 2)是一种在人类中由SIRT2基因编码的酶，SIRT2是一种NAD+依赖型(nicotinamide adenine dinucleotide)脱乙酰酶。SIRT2在脑内的表达水平比其他器官都高得多，其胞浆功能包括调节微管和乙酰化，控制中枢和周围神经系统的髓鞘形成，以及糖异生。越来越多的证据表明，SIRT2在大脑核具有额外的功能。在G2M转换过程中，核SIRT2负责H4K16的全局性去乙酰化，促进H4K20的甲基化和随后的染色质紧凑。此外，作为对DNA损伤的反应，SIRT2还被发现在体内对H3K56进行脱乙酰化[。SIRT2通过催化结构域内的一个自动修饰环的脱乙酰化，负调控转录共活化子p300的乙酰基转移酶P300的活性。
[0004]外泌体(exosomes)作为一种细胞分泌的磷脂双分子层微小囊泡，其本身含有来源于细胞的核酸、蛋白、脂质，且由于其被靶细胞摄取和运输内容物至靶细胞的功能，可作为药物递送载体进行靶向治疗。外泌体膜富含CD47蛋白，CD47作为信号调节蛋白α的蛋白配体，CD47
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SIRPα结合引发抑制吞噬作用信号，防止外泌体被单核细胞、巨噬细胞捕获摄取。研究显示，部分细胞分泌的外泌体膜表面存在多种类型的跨膜结构域融合的功能肽，M2型极化巨噬细胞分泌的外泌体表面富含整合素蛋白，可靶向单核巨噬细胞；外泌体膜含有乳凝集素C1C2结构域可显示出淋巴细胞靶向性。
[0005]糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinisotol,GPI)锚定蛋白(GPI
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APs)是广泛存在于动物界的膜结合蛋白，蛋白质部分锚定在质膜上，而GPI共价附于C末端，其中GPI部分由保守的核心聚糖、磷脂酰肌醇(PI)和聚糖侧链组成。GPI
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APs的组装在内质网，组装完成后转移到内腔，同时蛋白质的羧基末端被连接到GPI锚点上。GPI锚定蛋白通过磷酸乙
醇胺与甘露醇非乙酰化氨基葡萄糖(trimannosyl
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non
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acetylated glucosamine,Man3
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GlcN)核心的磷酸二酯键连接在其羧基末端。GlcN的还原端与磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)相连。然后，PI通过另一个磷酸二酯键通过其疏水区锚定到细胞膜上。GPI锚定蛋白的释放可以通过磷脂酶C，磷脂酰肌醇特异性(Phosphatidylinositolspecific,PLC
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PI)处理来完成。该酶特异性地水解磷脂酰肌醇的磷酸二酯键，形成游离的1，2
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二酰甘油和糖肽结合的肌醇环
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1，2
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磷酸。
[0006]在生命的各个领域中，绝大多数分泌蛋白的N端都带有一个短肽，称为信号肽(Signal Peptide)，其功能是促使细胞从蛋白质中移位，通常是转移到细胞膜上。在原核生物中，信号肽将新合成的蛋白质引导到存在于细胞膜上的SecYEG蛋白传导通道。真核生物中存在一个同源系统，信号肽将新合成的蛋白质导向Sec61信道，Sec61信道在结构和序列上与SecYEG有同源性，但存在于内质网中。SecYEG和Sec61通道通常被称为转位蛋白，通过这个通道的转运称为转位。当分泌的蛋白质穿过通道时，跨膜结构域可能会跨越转位子的侧门扩散到周围的膜上。
[0007]为了使外泌体具有靶向特性，以改善它们与靶器官或靶细胞的相互作用，可将信号肽与外泌体相结合，可使得承载着药物治疗剂的外泌体迅速准确抵达所需的靶器官或组织中。GPI锚定是外泌体工具箱中的一种新工具，如将编码抗表皮生长因子受体(EGFR)纳米体作肿瘤细胞靶向配体的载体转染外泌体产生细胞，并与衰变加速因子(DAF)衍生的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽融合。发现纳米体能通过GPI锚定在外泌体表面，从而改变外泌体的细胞靶向行为。

技术实现思路

[0008](一)专利技术目的
[0009]本研究拟构建一种含GPI锚定信号肽的重组质粒pMCP
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GPI
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Insulin，在GPI的作用下使产药细胞质膜表面锚定了胰岛素分子，外泌体分泌时通过膜融合携带胰岛素分子，使外泌体能靶向特定细胞。同时构建了携带Kex2分泌信号肽且高表达粘红酵母sirt2蛋白的重组质粒pFlag
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CMV
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Kex2
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Rsirt2，使产药细胞高表达sirt2蛋白并包裹到外泌体中，将该表达靶向分子的外泌体作用于小鼠肝脏氧化应激的模型细胞，显着改善因氧化应激引起的细胞线粒体结构损伤与功能下降。
[0010](二)技术方案
[0011](1)GPI
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Insulin的MSC外泌体及靶向性研究：根据GeneBank中GPI的基因序列，设计并合成GPI信号肽基因，构建重组载体pMCP
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GPI；提取胰岛细胞mRNA，经过RT
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PCR扩增构建pGEM
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T
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Insulin质粒；连接构建重组载体pMCP
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GPI
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Insulin；将pMCP
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GPI
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Insulin转染MSC细胞；离心提取MSC细胞培养上清的外泌体，通过BCA、Western blot、TEM、粒径分析确定外泌体的浓度、标志物、形貌和大小，再通过PKH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明公开了一种在GPI锚定蛋白引导下使胰岛素分子靶向到细胞膜上而形成的靶向外泌体的构建方法及其在重组生物药物传递应用。2.权利要求1所述的靶向外泌体涉及到pMCP
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GPI
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Insulin和pFlag
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CMV
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Kex2
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EK
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Rt
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sirt2两种质粒的构建。3.权利要求1所述的靶向外泌体，其特征在于：构建了pMCP
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GPI
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Insulin重组质粒，转染MSC细胞后表达的GPI锚定蛋白能使胰岛素分子锚定在细胞质膜上，细胞内产生的外泌体在分泌时通过膜融合携带胰岛素分子，使外泌体具有靶向胰岛素受体的能力。4.权利要求1所述的靶向外泌体在重组生物药物传递的应用，其特征在于：构建了pFlag
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CMV
‑2‑
Kex2
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EK
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Rt
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sirt2重组质粒，转染至MSC细胞后，Rt
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sirt2实现稳定高效表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晗笑，陈宥宇，邓健善，钟志颖，耿承旭，利时雨，
申请(专利权)人：艾威亚广州医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：