一种增强型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种增强型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。制备方法包括：构建获得IL

【技术实现步骤摘要】
一种增强型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于抗肿瘤细胞
，具体涉及一种增强型抗肿瘤NK细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节息息有关，其是用于过继性癌症免疫治疗的重要效应细胞类型。与T细胞类似，NK细胞也可以被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)来增强抗肿瘤活性。近年来基于NK细胞的CAR
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NK疗法也发展迅速。其独特优势主要体现在：NK细胞亚群少，体内存活时间短，不可预期风险低；更安全，细胞因子风暴和神经毒性发生的机率极低；NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性，且不受主要组织相容性复合体(MHC)限制性；由于免疫排斥机制，T细胞治疗目前多采用自体细胞，而已报道基于异体NK细胞的肿瘤免疫治疗均未见严重非可控移植物排斥宿主反应(GVHD)，扩宽了细胞的来源，为“现货型”细胞免疫治疗提供可行性。
[0003]CAR
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NK细胞治疗有诸多优点，但是在缺乏细胞因子信号的情况下NK细胞无法扩增并增强其效应功能。白介素
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12(IL
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12)是细胞免疫应答过程中的关键调节因子，能够激活NK细胞，促进其分泌大量的γ
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干扰素(IFN
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γ)，以抑制并杀伤肿瘤细胞，具有重要的生物活性。但是IL
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12全身给药时毒副作用很大且可能直接作用于NK细胞的浓度并不高，因此工程化CAR
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NK细胞组成性分泌IL
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12是一种有吸引力的策略，工程化细胞不仅可以识别自分泌IL
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12促进NK细胞的增殖和增强对肿瘤的杀伤作用，又可以因为CAR
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NK细胞的靶向肿瘤作用避免IL
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12造成的机体不良副反应。
[0004]NK
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92细胞是1992年从非霍奇金淋巴瘤病人的外周血淋巴细胞中分离出来并且成功建系的一种NK细胞系，已被美国FDA批准用于临床实验，其安全性和可行性也已经在多项临床试验中被验证。CD19是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，其在大多数急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤中表达。
[0005]WO2020051363A1公开了一种基于NK细胞的治疗的组合物和方法。即IL
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2表达或致敏的NK细胞，体内或者体外采用一种嵌合蛋白刺激，该嵌合蛋白包含癌细胞靶向部分和IL
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12部分。有利的效果显示这种嵌合蛋白可以显著降低全身毒性，并且还可以靶向诱导IFN
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γ分泌。NK细胞与嵌合蛋白接触的步骤离体进行或者使NK细胞与嵌合蛋白接触的步骤在体内进行。体内接触时给予NK细胞之前至少12小时给予嵌合蛋白，或者给予NK细胞后至少12小时给予嵌合蛋白，或者嵌合蛋白与NK细胞同时给予。然而，这种方法的局限性在于IL
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12体外刺激后除去IL
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12再进行输注治疗，NK细胞的效果可能会不显著；而体内输注刺激时IL
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12靶向嵌合蛋白可以依靠靶向作用到达肿瘤部位，但足够数量的NK细胞不一定能到达肿瘤的位置而导致治疗效果不显著。CN108047332A公开了一种以CD19为靶点的抗CD19抗体或其抗原结合片段，该现有技术构建的Anti CD19 CAR
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NK细胞为单克隆细胞株培养并扩增所得，其性状稳定，可用于大规模生产制备。Anti CD19 CAR
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NK细胞以CD19分子为靶抗原，
能够特异性地杀死或杀伤淋巴瘤细胞，可作为淋巴瘤类疾病的治疗药物用于CD19分子高表达的肿瘤的治疗。然而，NK细胞在缺乏细胞因子信号的情况下无法扩增并增强其效应功能，CD19为靶点的CAR
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NK细胞可能会存在靶向肿瘤细胞后，由于缺乏细胞因子造成NK细胞的杀伤活性不够，这也是目前NK细胞治疗共同面临的问题。

技术实现思路

[0006]基于现有技术存在的缺陷，本专利技术的第一目的在于提供一种增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法；本专利技术的第二目的在于提供该方法制备获得的增强型抗肿瘤NK细胞；本专利技术的第三目的在于提供该增强型抗肿瘤NK细胞在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
[0007]本专利技术的目的通过以下技术手段得以实现：
[0008]一方面，本专利技术提供一种增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其包括以下步骤：
[0009]将人工合成的IL
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12基因连接到慢病毒载体质粒上，构建获得IL
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12慢病毒表达载体；
[0010]将人工合成的CD19
‑
CAR基因连接到慢病毒载体质粒上，构建获得CD19
‑
CAR慢病毒表达载体；
[0011]将IL
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12慢病毒表达载体、CD19
‑
CAR慢病毒表达载体分别与慢病毒包装质粒共转染进293T细胞中并培养，分别收集获得富含IL
‑
12慢病毒颗粒、CD19
‑
CAR慢病毒颗粒的细胞上清液；浓缩后分别收集获得IL
‑
12慢病毒和CD19
‑
CAR慢病毒；
[0012]培养传代NK
‑
92细胞，将CD19
‑
CAR慢病毒和IL
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12慢病毒按照相同的MOI值共同感染NK
‑
92细胞，培养收集细胞，获得增强型抗肿瘤NK细胞。
[0013]上述的制备方法中，将CD19
‑
CAR慢病毒和IL
‑
12慢病毒按照相同的MOI值共同感染NK
‑
92细胞的方式可以为：将CD19
‑
CAR慢病毒和IL
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12慢病毒同一时间共同感染NK
‑
92细胞；或先将CD19
‑
CAR慢病毒感染NK
‑
92细胞，间隔一段时间(例如一周)后再将IL
‑
12慢病毒感染NK
‑
92细胞；或先将IL
‑
12慢病毒感染NK
‑
92细胞，间隔一段时间(例如一周)后再将CD19
‑
CAR慢病毒感染NK
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92细胞。
[0014]上述的制备方法中，优选地，所述慢病毒载体质粒包括PGMLV质粒。
[0015]上述的制备方法中，优选地，所述IL
‑
12基因是将天然的IL
‑
12基因的P40亚基基因和P35亚基基因通过连接肽基因连接后获得的。
[0016]上述的制备方法中，优选地，所述IL
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强型抗肿瘤NK细胞的制备方法，其包括以下步骤：将人工合成的IL
‑
12基因连接到慢病毒载体质粒上，构建获得IL
‑
12慢病毒表达载体；将人工合成的CD19
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CAR基因连接到慢病毒载体质粒上，构建获得CD19
‑
CAR慢病毒表达载体；将IL
‑
12慢病毒表达载体、CD19
‑
CAR慢病毒表达载体分别与慢病毒包装质粒共转染进293T细胞中并培养，分别收集获得富含IL
‑
12慢病毒颗粒、CD19
‑
CAR慢病毒颗粒的细胞上清液；浓缩后分别收集获得IL
‑
12慢病毒和CD19
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CAR慢病毒；培养传代NK
‑
92细胞，将CD19
‑
CAR慢病毒和IL
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12慢病毒按照相同的MOI值共同感染NK
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92细胞，培养收集细胞，获得增强型抗肿瘤NK细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述慢病毒载体质粒包括PGMLV质粒。3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述IL
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12基因是将天然的IL
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12基因的P40亚基基因和P35亚基基因通过连接肽基因连接后获得的；优选地，所述IL
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12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述CD19
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CAR基因是将人CD8α信号肽基因、靶向CD19单链抗体基因、人CD8α铰链区基因、人CD8α跨膜区基因、4
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1BB的胞内区基因、人CD3ζ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建刚，韩倩，胡祥维，王媛媛，吴明远，
申请(专利权)人：康立泰生物医药青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：