一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用。具体地，本发明专利技术利用胆红素氧化酶作为酚类受体，将其氧化酚类化合物时产生的法拉第电流作为传感的基础，在电极和胆红素氧化酶之间构建电子传递通道，并借助纳米金颗粒和基础蛋白将胆红素氧化酶高效组装在电极表面，从而构建成为单分子酶电化学酚类传感器。与传统的酶电化学传感器相比，本发明专利技术在酚类污染物的检测上具有高检测灵敏度、高定量准确性以及高酶活稳定性的技术优势，可实现对酚类污染物的实时在线定性定量检测。测。测。

【技术实现步骤摘要】
一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及电化学检测
，具体涉及一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]酚类化合物是生态环境中一类重要的毒害性有机污染物。环境中的酚类化合物来源广泛，主要包括工业废水和生活污水的排放、以及有机磷农药的降解，严重威胁生态安全和人类健康，亟需加强酚类污染物的监测预警及其强化治理。
[0003]传统上针对酚类化合物的分析检测手段主要是色谱和质谱技术，难以用来实现低成本、高通量的实时在线监测。生物电化学传感器可以很好地解决特殊污染物的实时在线检测难题。但是，目前的生物电化学传感器在技术上多通过蛋白涂覆加电子媒介导电的原理将污染物浓度转化为可检测电流，面临着检测灵敏度低、功能酶失活快、抗干扰能力差、定量可靠性一般等问题。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种新型单分子酶电化学酚类传感器及其制备方法与应用。
[0005]为了构建有技术经济价值的新型生物电化学酚类传感器，本专利技术选择胆红素氧化酶(BOD，下同，来源于漆斑菌属)作为酚的电化学受体，利用纳米金和基础蛋白在BOD和电极基底之间设计实现了独特的单分子界面，进一步改进酶电极的活性和稳定性，构建了基于“纳米金
‑
基础蛋白
‑
BOD”体系的单分子酶电化学酚类传感器。
[0006]本专利技术的技术思路是：通过电化学方法在导电、惰性的固体分析电极表面沉积金纳米颗粒；然后借助带巯基的羧酸或胺类化合物在金纳米颗粒表面修饰自组装单层；借助自组装单层以共价连接的方式将基础蛋白固定到金纳米颗粒表面，在电极表面得到单分子层的基础蛋白；将胆红素氧化酶共价连接到基础蛋白上，即制作成为单分子酶电化学酚类传感器。通过在电极表面和酶之间引入基础蛋白可以很好的改进酶电极的活性和稳定性，在适当电位下氧化酚类化合物产生特异性电流信号，作为对水样中酚类化合物定性和定量的依据。
[0007]因此，本专利技术的第一个目的是提供新型单分子酶电化学酚类传感器，所述的传感器包括电极基底，以及在电极基底表面上依次组装的金纳米颗粒层、基础蛋白和胆红素氧化酶，所述的基础蛋白通过带巯基的羧酸或胺类化合物以共价连接方式结合到金纳米颗粒表面上，所述的胆红素氧化酶以共价连接方式结合到基础蛋白上。
[0008]优选的，所述的电极基底的材质为金、铂、玻碳或者石墨。
[0009]优选的，所述的基础蛋白为导电蛋白或非导电蛋白。
[0010]优选的，所述的导电蛋白为多血红素细胞色素c或铁硫蛋白；所得的非导电蛋白为牛血清蛋白。
[0011]本专利技术的第二个目的是提供一种制备上述的新型单分子酶电化学酚类传感器的方法，包括以下步骤：在导电、惰性的固体分析电极表面上沉积金纳米颗粒；然后借助带巯基的羧酸或胺类化合物在金纳米颗粒表面上修饰自组装单层；借助自组装单层以共价连接的方式将基础蛋白固定到金纳米颗粒表面上，在电极表面得到单分子层的基础蛋白；将胆红素氧化酶共价连接到基础蛋白上，即制得单分子酶电化学酚类传感器。
[0012]优选的，所述的新型单分子酶电化学酚类传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0013](1)在三电极电化学体系中，以导电、惰性的固体分析电极为工作电极、铂丝为对电极、银/氯化银为参比电极，将电极共同浸没于含有氯金酸的电沉积液中，以循环伏安法将氯金酸根还原，使金纳米颗粒沉积在工作电极表面上；
[0014](2)将沉积金纳米颗粒的工作电极浸没在羧基化修饰液中6～48h，得到表面羧基化的纳米金颗粒电极；
[0015](3)将表面羧基化的纳米金颗粒电极用EDC
‑
NHS溶液进行处理，经水漂洗后，浸泡于基础蛋白溶液中，使基础蛋白共价固定到金纳米颗粒表面上，再用EDC
‑
NHS溶液进行处理，经水漂洗后，浸泡于胆红素氧化酶溶液中，制得单分子酶电化学传感器。
[0016]优选的，步骤(1)中，所述的导电、惰性的固体分析电极的材质为金、铂、玻碳或者石墨。
[0017]优选的，步骤(1)中，所述的电沉积液的组成为：1mM氯金酸，50mM硫酸钠，0.5M硫酸，溶剂为水；所述的循环伏安法的电势范围是
‑
1.4V～+0.6V，扫描速率是10～200mV/s，扫描循环数是5～20。
[0018]优选的，步骤(2)中，所述的羧基化修饰液的组成为：β
‑
巯基乙醇9mM，巯基乙酸1mM，溶剂为水。
[0019]优选的，步骤(3)中，所述的EDC
‑
NHS溶液的组成为：0.1M EDC，0.5M Sulfo
‑
NHS，0.1M吗啉乙磺酸，溶剂为水。
[0020]优选的，步骤(3)中，所述的基础蛋白为多血红素细胞色素c、铁硫蛋白或牛血清蛋白；所述的基础蛋白溶液的浓度为1μM，所述的胆红素氧化酶溶液的浓度为740U BOD/mL PBS缓冲液。
[0021]本专利技术的第三个目的是提供上述的新型单分子酶电化学酚类传感器在检测酚类污染物中的应用。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0023]本专利技术利用胆红素氧化酶作为酚类受体，将其氧化酚类化合物时产生的法拉第电流作为传感的基础，在电极和胆红素氧化酶之间构建电子传递通道，并借助纳米金颗粒和基础蛋白将胆红素氧化酶高效组装在电极表面，从而构建成为单分子酶电化学酚类传感器。与传统的酶电化学传感器相比，本专利技术在酚类污染物的检测上具有高检测灵敏度、高定量准确性以及高酶活稳定性的技术优势，可实现对酚类污染物的实时在线定性定量检测，具有较高的经济和技术价值。
附图说明
[0024]图1为“纳米金
‑
CctA
‑
BOD”电极示意图。
[0025]图2为“纳米金
‑
BOD”和“纳米金
‑
CctA
‑
BOD”体系传感2,4
‑
二氯苯酚的循环伏安图。
[0026]图3为2,4
‑
二氯苯酚浓度与传感器测试电流的拟合线性图。
[0027]图4为多次扫描过程中，缺少CctA的传感器(“纳米金
‑
BOD”)和添加CctA的传感器(“纳米金
‑
CctA
‑
BOD”)对2,4
‑
二氯苯酚的响应信号变化。
[0028]图5为多次扫描过程中，添加BSA的传感器(“纳米金
‑
BSA
‑
BOD”)对2,4
‑
二氯苯酚的响应信号变化。
具体实施方式
[0029]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0030]实施例1
[0031]1、单分子酶电化学酚类传感器(“纳米金
‑
CctA
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型单分子酶电化学酚类传感器，其特征在于，所述的传感器包括电极基底，以及在电极基底表面上依次组装的金纳米颗粒层、基础蛋白和胆红素氧化酶；所述的基础蛋白通过带巯基的羧酸或胺类化合物以共价连接方式结合到金纳米颗粒表面上，所述的胆红素氧化酶以共价连接方式结合到基础蛋白上。2.根据权利要求1所述的新型单分子酶电化学酚类传感器，其特征在于，所述的电极基底的材质为金、铂、玻碳或者石墨。3.根据权利要求1所述的新型单分子酶电化学酚类传感器，其特征在于，所述的基础蛋白为多血红素细胞色素c、铁硫蛋白或牛血清蛋白。4.一种制备权利要求1
‑
3任一项所述的新型单分子酶电化学酚类传感器的方法，其特征在于，包括以下步骤：在导电、惰性的固体分析电极表面上沉积金纳米颗粒；然后借助带巯基的羧酸或胺类化合物在金纳米颗粒表面上修饰自组装单层；借助自组装单层以共价连接的方式将基础蛋白固定到金纳米颗粒表面上，在电极表面得到单分子层的基础蛋白；将胆红素氧化酶共价连接到基础蛋白上，制得单分子酶电化学酚类传感器。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在三电极电化学体系中，以导电、惰性的固体分析电极为工作电极、铂丝为对电极、银/氯化银为参比电极，将电极共同浸没于含有氯金酸的电沉积液中，以循环伏安法将氯金酸根还原，使金纳米颗粒沉积在工作电极表面上；(2)将沉积金纳米颗粒的工作电极浸没在羧基化修饰液中6～48h，得到表面羧基化的纳米金颗粒电极；(3)将表面...

【专利技术属性】
技术研发人员：李道波，许玫英，郑晓丹，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：