一种电缆状脱细胞神经支架及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及神经再生生物学技术领域，尤其涉及一种电缆状脱细胞神经支架及其制备方法与应用。具体包括如下步骤：(1)将神经与洗液混合后震荡；(2)将步骤(1)得到的神经在依次使用4

【技术实现步骤摘要】
一种电缆状脱细胞神经支架及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及神经再生生物学
，尤其涉及一种电缆状脱细胞神经支架及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]临床上面神经涉及面神经主干及颞外多个分支部位的缺损，简称“全面神经缺损”常见于肿瘤根治术后，此处缺损的最大特点是神经分支呈电缆状，且分支类型及走行方向变异较大。目前，腓肠神经、耳大神经等自体神经移植仍是修复全面神经缺损的金标准，但有时需要选择多个供体或将其分成多股制成电缆状。另一方面，预制的标准化人工导管难以与全面神经缺损状况相吻合。因此，对电缆状天然神经支架(同种异体或异种神经支架)的需求增加。
[0003]同种异体或异种神经移植因排斥反应而导致失败，主要的抗原成分是雪旺细胞(Schwann cells)和髓鞘。化学脱细胞方法应用较为成熟，其中广为接受的是Sondell方法，即利用化学萃取剂(TritonX
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100和脱氧胆酸钠)以及低渗水溶液处理周围神经，获得的脱细胞神经(acellular nerve grafts，ANGs)是一种较理想的组织工程化神经，提供了一种有利于神经再生的低免疫、甚至非免疫环境，既能较好地清除引起排斥反应的主要抗原成分，又能保留促进神经再生的神经基底膜管及细胞外基质结构，引导宿主雪旺细胞和轴突沿其内管壁向移植段迁移和增殖。Sondell化学脱细胞方法制备的电缆状异体脱细胞神经移植物(allogeneicANGs)已经成功应用于临床上全面神经缺损修复，申请人2022年报道了(Zhu GC(朱国臣),Xiao DJ,ZhuBW,Xiao Y.Repairing whole facial nerve defects with xenogeneic acellular nerve grafts inrhesus monkeys.Neural Regen Res.2022,17:1131
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1137.)改良Sondell化学脱细胞方法制备的电缆状异种脱细胞神经移植物(xenogeneicANGs)应用于猕猴全面神经缺损修复。然而，化学脱细胞的过程中有一些环节需要改进：(1)低渗水溶液可引起神经组织结构明显肿胀；(2)化学萃取剂可能会对组织超微结构的保存造成过度破坏，使神经组织明显萎缩；(3)洗涤后支架内仍有细胞毒性残留物的可能，特别是细长的电缆状ANGs中段。
[0004]因此，如何开发一种促细胞凋亡辅助脱细胞方法，以克服化学萃取剂的缺点，不同于既往的化学脱细胞方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种电缆状脱细胞神经支架及其制备方法与应用，为了克服化学萃取剂的缺点，本专利技术利用小分子细胞毒素物质—喜树碱诱导周围神经中的细胞凋亡，然后用高渗磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)和脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease，DNase I)清除周围神经中的细胞片段和DNA碎片。脱细胞后的神经移植物保留了完整的细胞外基质结构，植入体内后显示具有免疫原性耐受。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种电缆状脱细胞神经支架的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)将神经与洗液混合后震荡；
[0009](2)将步骤(1)得到的神经再依次使用4
×
PBS缓冲液洗涤20～28h、2
×
PBS缓冲液洗涤25～35min和1
×
PBS缓冲液洗涤25～35min；
[0010](3)将步骤(2)得到的神经与DNase I混合处理，再使用1
×
PBS缓冲液洗涤后，使用1
×
PBS缓冲液保存；
[0011](4)将步骤(3)得到的神经
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CO辐射灭菌。
[0012]优选的，步骤(1)所述洗液为无血清DMEM
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F12和喜树碱；所述无血清DMEM
‑
F12和喜树碱的体积比为13～17:3～7。
[0013]优选的，步骤(1)所述震荡的时间为20～28h，温度为35～39℃。
[0014]优选的，步骤(3)所述DNase I的浓度为70～80U/mL。
[0015]优选的，步骤(3)所述处理的时间为32～40h。
[0016]优选的，步骤(3)所述洗涤的次数为2～4次，每次25～35min。
[0017]优选的，步骤(4)所述辐照剂量为10～14kGy；辐照时间为10～14h。
[0018]本专利技术还提供了所述的一种电缆状脱细胞神经支架的制备方法制备得到的电缆状脱细胞神经支架。
[0019]本专利技术还提供了所述的一种电缆状脱细胞神经支架的制备方法制备得到的电缆状脱细胞神经支架，所述的电缆状脱细胞神经支架在神经缺损修复中的应用。
[0020]本专利技术还进一步提供了喜树碱在电缆状脱细胞神经支架制备中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0022]1、本专利技术喜树碱洗液、PBS、DNase I等的用量没有具体要求，因为神经长短、粗细大小不一，试剂用量没过神经即可。
[0023]2、喜树碱促细胞凋亡方法与Sondell化学萃取方法比较具有以下优势：
[0024]避免了对脱细胞神经支架细胞外基质的影响。
[0025]喜树碱促细胞凋亡方法中首个步骤选用喜树碱处理神经，既可诱导凋亡的早期标志物表达，也可诱导晚期标志物TUNEL
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DNA断裂，并能诱导周围神经中许多不同类型的细胞凋亡。在细胞凋亡过程中，细胞与细胞外基质分离，降解其内部成分，并使其内容物碎裂形成凋亡小体以便于清除。避免了Sondell化学萃取方法中首个步骤选用的低渗水溶液细胞外基质的影响。
[0026]减轻了对脱细胞神经支架组织超微结构的破坏作用。
[0027]喜树碱促细胞凋亡方法中后续选用高渗磷酸盐缓冲盐水温和冲洗以及脱氧核糖核酸酶I处理神经，二者以凋亡依赖的方式使DNA含量显著降低，代替了Sondell化学萃取方法中以破坏性试剂清除细胞碎片的方法，减轻了化学萃取剂对组织超微结构的可能过度破坏作用。
[0028]早期肌内植入炎症反应轻微。
[0029]喜树碱促细胞凋亡方法制备的脱细胞神经支架行肌内植入1周时的局部炎症反应轻于Sondell化学萃取方法，两组后续时间段的反应程度相似。
[0030]降低了残留细胞毒性。
[0031]喜树碱促细胞凋亡方法制备的脱细胞神经支架因仅使用了低浓度的喜树碱，且经
后续高渗磷酸盐缓冲盐水温和冲洗以及脱氧核糖核酸酶I后细胞毒性较低，与雪旺细胞体外培养无明显毒性。而Sondell化学萃取方法制备的脱细胞神经支架，特别是细长支架，因化学萃取剂未能完全自支架两端清除而有残留细胞毒性的可能。
附图说明...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种电缆状脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将神经与洗液混合后震荡；(2)将步骤(1)得到的神经再依次使用4
×
PBS缓冲液洗涤20～28h、2
×
PBS缓冲液洗涤25～35min和1
×
PBS缓冲液洗涤25～35min；(3)将步骤(2)得到的神经与DNaseI混合处理，再使用1
×
PBS缓冲液洗涤后，使用1
×
PBS缓冲液保存；(4)将步骤(3)得到的神经
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CO辐射灭菌。2.根据权利要求1所述的一种电缆状脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述洗液为无血清DMEM
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F12和喜树碱；所述无血清DMEM
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F12和喜树碱的体积比为13～17:3～7。3.根据权利要求1所述的一种电缆状脱细胞神经支架的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国臣，潘瑶，唐笠，董姝贤，
申请(专利权)人：无锡市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：