一种蛋白酶抑制剂混合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种蛋白酶抑制剂混合物及其制备方法与应用。所述蛋白酶抑制剂混合物包括如下组分：PMSF、Aprotinin、Bestatin、E

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白酶抑制剂混合物及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种蛋白酶抑制剂混合物及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]蛋白质(protein)是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与，人体全部质量的18％由蛋白质组成，最重要的还是其与生命现象有关。蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者，没有蛋白质就没有生命。蛋白质的种类很多，性质、功能各异，整个生物
离不开对蛋白质组分研究，在研究过程中则需要纯化目的蛋白质；在纯化过程中，一种蛋白酶微量的污染就会产生很大的影响。在对细胞总蛋白提取时，细胞中的多种内源性蛋白酶会对目的蛋白剪切成小片段，从而增加提取的难度。
[0003]蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)从广义上指是与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。蛋白酶抑制剂的添加可以保护目的蛋白的完整性。市面上的蛋白酶抑制剂混合物成分通常不全或不同的蛋白酶抑制剂之间的配比不合理而导致效果不好；同时，蛋白酶抑制剂溶剂通常为纯水、二甲基亚砜、N,N
‑
二甲基甲酰胺等溶解性存在差异，存在溶解不充分的情况。
[0004]实验室中常用SDS或者RIPA裂解液裂解细胞，从得到的裂解液中检测目的蛋白，这种检测方法存在以下问题：细胞中含有多种不同的内源性蛋白酶，在总蛋白提取过程，我们需要的目的蛋白可能被蛋白酶水解成片段，从而失去蛋白质的完整性，并且改变它们的结构和功能特性，不利于后续免疫学实验的进行；对于消化系统相关的组织样本和淋巴细胞相关的样品，内源性蛋白酶含量及其丰富，使得提取完整的蛋白质非常不容易。
[0005]有鉴于此，有必要开发一种蛋白酶抑制剂混合物来解决上述问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛋白酶抑制剂混合物及其制备方法与应用。解决现有的市面上的蛋白酶抑制剂混合物成分通常不全或不同的蛋白酶抑制剂之间的配比不合理而导致效果不好；同时，蛋白酶抑制剂溶剂通常为纯水、二甲基亚砜、N，N
‑
二甲基甲酰胺等溶解性存在差异，存在溶解不充分的情况等问题。
[0007]本专利技术的一个目的在于提供一种蛋白酶抑制剂混合物。
[0008]一种蛋白酶抑制剂混合物，所述蛋白酶抑制剂混合物包括如下组分：PMSF、Aprotinin、Bestatin、E
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64、Leupeptin、Pepstatin、Phosphoramidon、异丙醇和 DMSO。
[0009]进一步地，所述蛋白酶抑制剂混合物中各组分的含量如下：所述PMSF的浓度为100～200mM，所述Aprotinin的浓度为15～80μM，所述Bestatin的浓度为5～20μM，所述E
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64的浓度为0.5～2μM，所述Leupeptin的浓度为0.5～2μM，所述Pepstatin的浓度为0.5～2μM，所述Phosphoramidon的浓度为0.1～2μM，所述异丙醇的质量浓度为50～70％，所述DMSO的质
量浓度为30～50％。
[0010]进一步地，所述蛋白酶抑制剂混合物还包括葡萄糖酸和乙酸钠。
[0011]更进一步地，所述葡萄糖酸的浓度为10～20μM，所述乙酸钠的浓度为5～ 10μM。
[0012]进一步地，所述蛋白酶抑制剂混合物中各组分的含量如下：所述PMSF的浓度为150mM，所述Aprotinin的浓度为50μM，所述Bestatin的浓度为12μM，所述E
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64的浓度为1μM，所述Leupeptin的浓度为1μM，所述Pepstatin的浓度为1μM，所述Phosphoramidon的浓度为1μM，所述葡萄糖酸的浓度为15μM，所述乙酸钠的浓度为7μM，所述异丙醇的质量浓度为60％，所述DMSO的质量浓度为40％。
[0013]本专利技术的另一个目的在于提供一种蛋白酶抑制剂混合物的制备方法。
[0014]上述任一项所述的蛋白酶抑制剂混合物的制备方法，包括如下步骤：
[0015]S1、按照所述蛋白酶抑制剂混合物中各组分的含量，准确称取PMSF、Aprotinin、Bestatin、E
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64、Leupeptin、Pepstatin、Phosphoramidon、葡萄糖酸和乙酸钠溶于异丙醇和DMSO的混合溶剂中，混合均匀后，配制成100
×
的母液；
[0016]S2、将所述100
×
的母液分装，并置于
‑
20℃的条件下保存；使用时，稀释 100倍即可。
[0017]本专利技术最后提供了一种上述任一项所述的蛋白酶抑制剂混合物在蛋白提取和检测中的应用。
[0018]进一步地，所述蛋白提取和检测包括蛋白纯化、蛋白免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0020]1)本专利技术公开了一种高效、广谱的蛋白酶抑制剂混合物配方，该混合物能够显著的使内源性蛋白酶活力下降，甚至消失，从而保护目的蛋白的完整性；其中，PMSF抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，Aprotinin抑制丝氨酸蛋白酶，Bestatin抑制氨肽酶，E
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64抑制半胱氨酸蛋白酶，Leupeptin抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶，Pepstatin抑制天冬氨酸蛋白酶，Phosphoramidon抑制金属蛋白酶，上述各种蛋白酶抑制剂协同作用，使得蛋白酶抑制剂混合物具有广谱的抑制效果；同时，异丙醇和DMSO的混合溶剂能够极大的提高各种蛋白酶抑制剂的溶解性，进一步起到促进抑制内源性蛋白酶活性的作用，从而提高蛋白酶抑制剂混合物的抑制效果；另外，葡萄糖酸含有大量的羟基和羧基，能够破坏内源性蛋白酶中的氢键，使得其活性中心暴露出来，便于各种蛋白酶抑制剂与内源性蛋白酶活性中心结合，进一步加强了抑制效果；乙酸钠为一种助溶剂，使得各种蛋白酶抑制剂溶解性更好，不易结晶析出，两者协同作用，进一步加强了蛋白酶抑制剂的抑制效果；
[0021]2)本专利技术的蛋白酶抑制剂混合物有利于western blot对于目的蛋白的检测，可以有效保护蛋白质的完整性，对蛋白的结构功能及后续免疫学实验影响较小，因此，该蛋白酶抑制剂混合物广泛应用于蛋白纯化、蛋白免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等蛋白提取和检测中。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于
本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为本专利技术实施例1中U
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937 cell总蛋白用于检测Beta actin蛋白的WB 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶抑制剂混合物，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂混合物包括如下组分：PMSF、Aprotinin、Bestatin、E
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64、Leupeptin、Pepstatin、Phosphoramidon、异丙醇和DMSO。2.根据权利要求1所述的蛋白酶抑制剂混合物，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂混合物中各组分的含量如下：所述PMSF的浓度为100～200mM，所述Aprotinin的浓度为15～80μM，所述Bestatin的浓度为5～20μM，所述E
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64的浓度为0.5～2μM，所述Leupeptin的浓度为0.5～2μM，所述Pepstatin的浓度为0.5～2μM，所述Phosphoramidon的浓度为0.1～2μM，所述异丙醇的质量浓度为50～70%，所述DMSO的质量浓度为30～50%。3.根据权利要求2所述的蛋白酶抑制剂混合物，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂混合物还包括葡萄糖酸和乙酸钠。4.根据权利要求3所述的蛋白酶抑制剂混合物，其特征在于，所述葡萄糖酸的浓度为10～20μM，所述乙酸钠的浓度为5～10μM。5.根据权利要求4所述的蛋白酶抑制剂混合物，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂混合物中各组分的含量如下：所述PMSF的浓度为150mM，所述Aprotinin...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏剑虹，练杨华，聂寒，项雨厚，
申请(专利权)人：武汉三鹰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：