一种基于细胞因子测定的生物制剂免疫活性物质挖掘与评价方法技术

本发明专利技术涉及一种基于细胞因子测定的生物制剂免疫活性物质挖掘与评价方法：包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备，(2)参考品溶液的制备：用无菌水溶解参考链，稀释后作为参考品溶液，(3)巨噬细胞培养：取未极化巨噬细胞，进行培养和铺板，(4)药物与细胞共孵育，(5)细胞因子检测；(6)功能指数测定：将步骤(5)测得供试品、参考品溶液刺激巨噬细胞释放TNF

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞因子测定的生物制剂免疫活性物质挖掘与评价方法


[0001]本专利技术属于医药
，特别是涉及一种基于细胞因子测定的生物制剂免疫活性物质挖掘与评价方法。

技术介绍

[0002]生物制剂特别是多糖核酸免疫调节药物如卡介菌多糖核酸中含有以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为基元构成的特定结构。许多研究表明,CpG DNA是否具有免疫活性关键取决于其是否含有非甲基化或低甲基化的CpG序列。CpG序列被Toll样受体9(TLR9)识别，TLR9是一种模式识别受体，主要位于抗原呈递细胞。CpG ODNs激活TLR 9启动MyD88依赖的MAPKs和NFκB信号通路，诱导多种免疫细胞的成熟、分化和增殖。这些细胞诱导分泌多种促炎细胞因子，如白细胞介素6(IL
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6)、肿瘤坏死因子
‑
α(TNF
‑
α)和趋化因子，进一步调节先天和适应性免疫反应。因此，CpG ODNs已成为一种有前途的免疫治疗剂，用于治疗各种疾病，包括癌症，过敏和传染病。
[0003]目前，单纯以化学成分(群)分离鉴定为中心的筛选方式难以解决卡介菌多糖核酸生物制剂有效成分不明、指标性成分不足等问题。国内外建立起的色谱
‑
质谱分离纯化鉴定活性物质、细胞实验筛选活性、动物实验验证活性等常规卡介菌生物制剂筛选策略费时费力费钱。因此，快速、准确的筛选是否存在有效活性成分物质或对药品的有效性进行评价依然是生物制剂研究的热点和难点，也是制约生物制剂现代化和产业化的“瓶颈”。
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技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供一种快速有效的基于细胞因子测定的生物制剂免疫活性物质挖掘与评价方法。
[0005]一种基于细胞因子测定的生物制剂免疫活性物质挖掘与评价方法，包括以下步骤：
[0006](1)供试品溶液的制备：提取所述生物制剂中的生物物质，无菌水溶解后制备成供试品溶液；
[0007](2)参考品溶液的制备：用无菌水溶解参考品，稀释后作为参考品溶液；
[0008](3)巨噬细胞培养：取未极化巨噬细胞，进行培养和铺板；
[0009](4)药物与细胞共孵育：将步骤(1)的供试品溶液和步骤(2)的参考品溶液，分别加入步骤(3)得到的细胞中，置于培养箱内共培养，离心，收集上清液，分别得到参考品组和供试品组；
[0010](5)细胞因子检测：将步骤(4)所得上清液采用ELISA夹心法进行检测，以无菌水溶解细胞因子(CF)冻干粉得到标准品溶液，以标准品组测定的OD值与空白孔的OD值差值为纵坐标测得吸光度为纵坐标和标准品梯度浓度为横坐标制作标准曲线，获得标准曲线公式[1]，测得公式R2应在0.99以上；测得参考品组和供试品组的OD值；按公式[1]分别计算出参
考品和供试品溶液刺激巨噬细胞释放细胞因子(CF)浓度；
[0011]公式[1]为：[CF]＝aA+b
[0012]其中：[CF]为CF浓度，单位pg/mL；
[0013]A为测得吸光度值；
[0014]a为标准曲线斜率，参考值为0.001
±
0.0002；
[0015]b为标准曲线截距，参考值为0.1
±
0.03；
[0016](6)功能指数测定：将步骤(5)测得供试品、参考品溶液刺激巨噬细胞释放TNF
‑
α浓度，按公式[2]计算供试品溶液刺激巨噬细胞释放细胞因子的功能指数(I
FC
)；
[0017]公式[2]为：I
FC
＝([CF]测
‑
[CF]低
)/([CF]高
‑
[CF]低
)
[0018][CF]测
为供试品溶液细胞因子(CF)浓度；
[0019][CF]低
为极低值参考品溶液细胞因子(CF)浓度；
[0020][CF]高
为极高值参考品溶液细胞因子(CF)浓度。
[0021]优选地，所述步骤(1)中所述供试品中生物物质为提取纯化得到的核酸组分；所述核酸组分为采取核酸纯化柱法从多糖核酸免疫调节药物中提取获得，用无菌水溶解后得供试品原液；利用超微量分光光度计进行浓度测定，储存于
‑
20℃冰箱内备用；使用时，用无菌水稀释至6
‑
10μg/mL，获得供试品溶液。
[0022]步骤(1)中提取所述多糖核酸免疫调节药物中的核酸组分的方法包括以下步骤：将所述多糖核酸免疫调节药物与BABuffer混合均匀后，转移至核酸纯化柱，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入G Binding Buffer，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入Wash Buffer，离心后弃去接液管中液体；再向纯化柱中加Elution Buffer，室温温育，然后离心并收集接液管中液体，即得。
[0023]优选地，所述步骤(2)中参考品为生物公司合成的寡核苷酸链，其中选择国际认可核苷酸链(CpG1826序列为：TCCATGACGTTCCTGACGTT)为极高值参考品，以源自卡介菌的核苷酸链(序列为：GGTGGCCACCATGGACGTGG)为极低值参考品；参考品用无菌水溶解，并稀释至与供试品溶液同等浓度6
‑
10μg/mL，作为参考品溶液。
[0024]优选地，步骤(3)中巨噬细胞的培养和铺板为：
[0025]巨噬细胞培养：巨噬细胞RAW264.7用含10％胎牛血清，0.5％mg/mL双抗的DMEM培养基在5％的CO2培养箱中37℃培养；换液时，使用巴氏吸管将旧培养基吸走，加2
‑
3mL新培养基洗涤，弃培养液；再往培养瓶加入3mL新培养基，使用巴氏吸管进行吹吸，将壁上的细胞吹下来(力度适中)，之后吹打均匀，显微镜下观察细胞形态，是否圆润、均匀分散，如出现极化现象(成多边形)，则重新更换细胞；取一个新的培养瓶，加入5mL培养基，吸取一定体积的细胞悬液至新培养瓶，吹打均匀，显微镜下观察，调整密度；
[0026]巨噬细胞铺板：巨噬细胞RAW264.7长到培养瓶70％以上可用于实验；使用巴氏吸管将旧培养基吸走，加2
‑
3mL新培养基洗涤，弃培养液；再往培养瓶加入3mL新培养基，使用巴氏吸管进行吹吸，将壁上的细胞吹下来(力度适中)，之后吹打均匀，显微镜下观察细胞形态，是否分散；加入培养基制成细胞悬液，计数并调整细胞浓度为1
×
106/mL；将细胞接种于24孔培养板内，然后置37℃,5％CO2,95％湿度的培养箱内培养24h。
[0027]优选地，步骤(4)为：将步骤(1)的供试品溶液和步骤(2)的参考品溶液分别加入步骤(3)中细胞铺板得到细胞中，置于37℃,5％CO2,95％湿度的培养箱内共培养8h后，1000
×
g离心20min，取上清液，分别得到供试品组和参考品组，进行检测。
[0028]优选地，所述细胞因子为TN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞因子测定的生物制剂免疫活性物质挖掘与评价方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：提取所述生物制剂中的生物物质，无菌水溶解后制备成供试品溶液；(2)参考品溶液的制备：用无菌水溶解参考品，稀释后作为参考品溶液；(3)巨噬细胞培养：取未极化巨噬细胞，进行培养和铺板；(4)药物与细胞共孵育：将步骤(1)的供试品溶液和步骤(2)的参考品溶液，分别加入步骤(3)得到的细胞中，置于培养箱内共培养，离心，收集上清液，分别得到参考品组和供试品组；(5)细胞因子检测：将步骤(4)所得上清液采用ELISA夹心法进行检测，以无菌水溶解细胞因子(CF)冻干粉得到标准品溶液，以标准品组测定的OD值与空白孔的OD值差值为纵坐标测得吸光度为纵坐标和标准品梯度浓度为横坐标制作标准曲线，获得标准曲线公式[1]，测得公式R2应在0.99以上；测得参考品组和供试品组的OD值；按公式[1]分别计算出参考品和供试品溶液刺激巨噬细胞释放细胞因子(CF)浓度；公式[1]为：[CF]＝aA+b其中：[CF]为CF浓度，单位pg/mL；A为测得吸光度值；a为标准曲线斜率，参考值为0.001
±
0.0002；b为标准曲线截距，参考值为0.1
±
0.03；(6)功能指数测定：将步骤(5)测得供试品、参考品溶液刺激巨噬细胞释放细胞因子(CF)浓度，按公式[2]计算供试品溶液刺激巨噬细胞释放细胞因子的功能指数(I
FC
)；公式[2]为：I
FC
＝([CF]
测
‑
[CF]
低
)/([CF]
高
‑
[CF]
低
)[CF]
测
为供试品溶液细胞因子(CF)浓度；[CF]
低
为极低值参考品溶液细胞因子(CF)浓度；[CF]
高
为极高值参考品溶液细胞因子(CF)浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述供试品中生物物质为提取纯化得到的核酸组分。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中核酸组分为采取核酸纯化柱法从生物制剂中提取获得，用无菌水溶解后得供试品原液；利用超微量分光光度计进行浓度测定，储存于
‑
20℃冰箱内备用；使用时，用无菌水稀释至6
‑
10μg/mL，获得供试品溶液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中参考品为生物公司合成的寡核苷酸链，其中选择国际认可核苷酸链(CpG1826序列为：TCCATGACGTTCCTGACGTT)为极高值参考品，以源自卡介菌的核苷酸链(序列为：GGTGGCCACCATGGACGTGG)为极低值参考品；参考品用无菌水溶解，并稀释至与供试品溶液同等浓度，作为参考品溶液。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中巨噬细胞的培养和铺板具体步骤为：巨噬细胞培养：巨噬细胞RAW264.7用含10％胎牛血清，0.5％mg/mL双抗的DMEM培养基在5％的CO2培养箱中37℃培养；换液时，使用巴氏吸管将旧培养基吸走，加2
‑
3mL新培养基洗涤，弃培养液；再往...

【专利技术属性】
技术研发人员：周云喜，童春义，杨胜梅，黄胜，
申请(专利权)人：九芝堂股份有限公司，
类型：发明
国别省市：