一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法技术

一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因检测方法，包括：确定热带念珠菌的七种耐药基因ERG11、FKS1、MDR1、TAC1、UPC2、MRR1、ERG3及其SNP位点，针对其中的SNP位点设计多重PCR引物及MPE引物；通过提取热带念珠菌DNA并进行多重PCR扩增，SAP消化后进行质量探针延伸反应及树脂除盐，然后质谱上机，以核酸片段质荷比的差异作为结果检测信号，对热带念珠菌的耐药基因序列有无突变进行快速判读。本发明专利技术具有周期短、通量高、准确度高、精确度高、成本低等特点，为临床对于热带念珠菌耐药基因的检测提供了可靠有效的方法。了可靠有效的方法。了可靠有效的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测技术，涉及核酸质谱技术，具体来说是一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，机会性真菌感染在临床上的发生率不断增加，念珠菌是临床上引起机会性真菌感染最常见的病原菌，其中热带念珠菌的分离比率持续增高。由于抗真菌药在真菌疾病预防和治疗方面的广泛应用，热带念珠菌的耐药率呈逐步增加趋势。热带念珠菌对临床常用的抗真菌药物耐药率高，因此常导致抗真菌治疗无效。目前对热带念珠菌耐药机制的研究主要涉及唑类、棘白菌素和两性霉素B，相应的耐药基因主要有ERG11、UPC2、MDR1、及FKS1等。
[0003]ERG11基因编码合成的14
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α去甲基化酶是念珠菌细胞中的麦角固醇合成的关键酶。麦角固醇可维持细胞膜正常的结构，是念珠菌细胞膜的主要固醇，也是保持细胞膜完整性和流动性的重要结构。唑类药物作用靶点为念珠菌细胞膜上的14
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α去甲基化酶，影响酶与底物结合，从而阻断念珠菌细胞膜中麦角固醇的生物合成，发挥抗真菌作用。ERG11基因突变从而导致其编码的酶的空间结构及其生物活性发生改变，导致念珠菌对唑类的亲和力下降，从而对唑类药物敏感性下降甚至耐药。
[0004]UPC2基因编码产物为锌簇转录因子，具有转录调节功能，可调控ERG11基因的表达，ERG11基因过表达也是唑类耐药的一种机制。UPC2基因突变可以引起ERG11基因表达上调从而导致念珠菌对唑类药物耐药。r/>[0005]ERG3基因也是固醇通路基因的一员，其突变失活与唑类和两性霉素B耐药均相关。
[0006]念珠菌编码的药物外排转运蛋白，对唑类药物敏感性具有潜在影响，其可作为唑类药物的转运基质，降低药物有效细胞浓度使其低于目标抑菌阈值。多药外排转运蛋白的过表达是公认的一种耐药机制，赋予菌株对唑类抗真菌药物的耐药性。念珠菌中两大外排泵为CDR基因编码的ABC转运蛋白及MDR1基因编码的MFS转运蛋白。
[0007]TAC1和MRR1基因编码的锌簇转录因子，其突变可分别调节CDR和MDR基因的表达，这一潜在的过表达机制是唑类耐药的一个重要组分。
[0008]棘白菌素是临床治疗侵袭性念珠菌病的一线药物，随着它的广泛应用，出现了耐药的热带念珠菌。FKS1、FKS2、FKS3基因编码合成的蛋白Fks是真菌细胞壁β
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1，3
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D葡聚糖合酶的一个亚单位，也是棘白菌素发挥抗真菌作用的靶点。热带念珠菌对棘白菌素耐药主要与FKS1基因突变相关。
[0009]ERG11:GenBank accession number：M23673；SEQ ID NO.71
[0010]FKS1:GenBank accession number：EU676168.2；SEQ ID NO.72
[0011]MDR1:GenBank accession number：XM_002548069；SEQ ID NO.73
[0012]TAC1:GenBank accession number：XM_002550963.1；SEQ ID NO.74
[0013]UPC2:GenBank accession number：NW_003020056.1；SEQ ID NO.75
[0014]MRR1:GenBank accession number：XM_002547926.1；SEQ ID NO.76
[0015]ERG3:GenBank accession number：XM_002550136；SEQ ID NO.77。
[0016]研究热带念珠菌对常见抗真菌药物的耐药机制不仅可以提供抗真菌治疗的预后价值，而且有助于研发新型抗真菌药物。传统耐药表型检测技术如生化鉴定和药敏试验存在时间长、鉴定速度慢等缺点，往往不能满足临床需求。随着耐药机理的研究深入，分子生物学检测方法逐步展开应用，主要有聚合酶链式反应(PCR)、限制性片段长度多态性(PCR
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RFLP)分析、PCR
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SSCP分析、荧光定量PCR技术(TaqMan探针)、基因芯片技术、二代测序。
[0017]上述各分子生物学检测技术的原理及缺点如下：
[0018]PCR技术是基于DNA的半保留复制机制，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法，但其检测通量少、效率低；
[0019]PCR
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RFLP技术是使用特异性内切酶将PCR扩增得到的目的片段进行切割，因不同等位基因的限制性酶切位点不同，可得到不同长度的DNA片段，最后通过凝胶电泳进行分辨，但其对样品纯度要求较高、样品用量大、RFLP多态信息含量低、多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制；
[0020]PCR
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SSCP技术是PCR扩增后的DNA片段变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时形成不同的立体构象并影响泳动速率，相同长度的DNA片段仅一个碱基的差异即可影响泳动变位，从而鉴别有无基因突变，但此方法只能检测是否存在基因突变，不能确定突变的位置和类型；
[0021]荧光定量PCR技术(TaqMan探针)依据目的基因设计与其特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团，体系中会含有针对不同基因型的探针(携带不同的荧光基团)，从而实现基因突变的检测，但此方法通量低；
[0022]基因芯片技术采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，与待测样品按碱基配对原则进行杂交，从而检测特定基因，但此方法实验成本较高；
[0023]二代测序是一种高通量测序方法，用于对DNA或RNA样本的碱基对进行快速测序，但其实验操作及数据分析的过程极其耗时，成本较高。
[0024]目前临床对于热带念珠菌耐药的检测主要基于传统的耐药表型检测、PCR和二代测序，传统的生化鉴定和药敏试验时间长、鉴定速度慢，PCR检测通量低，而二代测序耗时长、数据分析复杂、成本高，因此以上常用的几种检测方法均不能很好的满足临床大量、快速检测的需求。
[0025]综上所述，本专利技术旨在提供一种快速、准确、通量高且成本低的热带念珠菌耐药基因的检测方法。

技术实现思路

[0026]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法，所述的这种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法要解决现有技术中的检测热带念珠菌耐药基因的方法周期长、通量低、成本高的技术问题。
[0027]本专利技术提供了一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法，其特征
在于包括如下步骤：
[0028]1)确定热带念珠菌的七种耐药基因ERG11、FKS1、MDR1、TAC1、UPC2、M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)确定热带念珠菌的七种耐药基因ERG11、FKS1、MDR1、TAC1、UPC2、MRR1、ERG3及其SNP位点；所述的ERG11的基因序列如SEQ ID NO.71所示；所述的FKS1的基因序列如SEQ ID NO.72所示；所述的MDR1的基因序列如SEQ ID NO.73；所述的TAC1的基因序列如SEQ ID NO.74所示；所述的UPC2的基因序列如SEQ ID NO.75所示；所述的MRR1的基因序列如SEQ ID NO.76所示；所述的ERG3的基因序列如SEQ ID NO.77所示；2)基于上述七种耐药基因的参考菌株序列，针对其中的SNP位点设计多重PCR引物及MPE引物；3)通过提取热带念珠菌DNA并进行多重PCR扩增，SAP消化后进行质量探针延伸反应及树脂除盐；4)质谱上机，以核酸片段质荷比的差异作为结果检测信号，对热带念珠菌的耐药基因序列有无突变进行快速判读。2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术的热带念珠菌耐药基因的检测方法，其特征在于，上述七种耐药基因ERG11、FKS1、MDR1、TAC1、UPC2、MRR1、ERG3的38个SNP位点如下所示，3....

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文娟，张旻，胡靓，王玉玺，刘东青，万菲菲，
申请(专利权)人：融智生物科技青岛有限公司，
类型：发明
国别省市：