亚胺还原酶突变体、亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种亚胺还原酶突变体，以及这种亚胺还原酶突变体用于制备(S)

【技术实现步骤摘要】
亚胺还原酶突变体、亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶及其应用
[
][0001]本专利技术涉及医药化工领域，具体涉及一种亚胺还原酶突变体，以及这种突变体的应用，还涉及这种亚胺还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶的共表达酶以及这种共表达酶的应用。
[
技术介绍
][0002](S)
‑
尼古丁是一种存在茄科植物的生物碱，也是烟草的重要成分。虽然有化学合成法的相关报道，但是合成的是(R,S)
‑
尼古丁，经拆分后才能获得(S)
‑
尼古丁。所以化学合成成本比从烟叶中提取烟碱的成本要高。
[0003]使用酶催化的方式催化制备(S)
‑
尼古丁，大大降低制备的成本，而且绿色环保。
[0004]Koichi Mitsukura等人在2010年发现Streptomyces sp.GF3587和3546的亚胺还原酶(Org.Biomol.Chem.,2010,8,4533
‑
4535)。使用这两种酶将2
‑
MPN还原为S
‑
2MP或者R
‑
2MP。
[0005]专利WO2014174505公开使用sp.GF3587和3546制备尼古丁的方法。反应底物为4
‑
(甲胺基)
‑1‑
(吡啶
‑3‑
基)丁酮，转化率仅有23％，而且仅能制备(R)
‑
尼古丁。
[0006]专利WO2020098978中公开了使用亚胺还原酶制备(S)
‑
尼古丁方法。亚胺还原酶催化麦思明为去甲烟碱，去甲烟碱甲基化后得到(S)
‑
尼古丁。使用的酶转化率在8小时后的可以达到77％，24小时后达到99％，专利中使用的酶来自Enzymicals。
[0007]现在公开使用酶催化制备(S)
‑
尼古丁的技术，酶活性不够，或者仅能制备(R)
‑
尼古丁。为此需要一种新的亚胺还原酶，能够催化底物制备(S)
‑
尼古丁，而且酶的活性更高，在较高的底物起始浓度下，具有较高的转化率和光学纯度。
[0008]另外，亚胺还原酶是一种依赖辅酶NADPH的氧化酶，而专利WO2014174505、WO2020098978中的亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶都是单独制备后混合使用，这种方式增加了制备酶的步骤，提高了获得酶的成本。李骥璇等(生物技术通报，2019,35(1)：105
‑
111)公开了S
‑
亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成，可以将亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共同表达，降低了使用酶的成本。但是李骥璇等公开的共表达系统仅公开了催化2
‑
MPN还原为S
‑
2MP的反应，而且一般的葡萄糖脱氢酶的活性要大于亚胺还原酶，共表达系统的亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶是等量的，这使得葡萄糖脱氢酶过量，在实际生产中，过量的酶易引起乳化，给后面的提纯带来不便。为了解决这个问题，需要一种活性更高的亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶一起形成共表达酶，并且能够催化底物生成(S)
‑
尼古丁。
[
技术实现思路
][0009]本专利技术第一个目的是提供了一种亚胺还原酶突变体，解决现有技术使用酶得不到S构型的尼古丁，以及现有技术中酶活性低的问题，这种突变体可以将底物麦思明或4
‑
(甲胺基)
‑1‑
(吡啶
‑3‑
基)丁酮催化还原为(S)
‑
尼古丁。
[0010]本专利技术第二个目的是提供这种亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶，具体是亚胺还原酶突变酶与葡萄糖脱氢酶的共表达酶，这种共表达酶应用与制备(S)
‑
尼古丁，降低了酶催化制备(S)
‑
尼古丁的成本。
[0011]为了达到专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0012]亚胺还原酶突变体，与氨基酸序列SEQ ID NO：1相比，存在残基差异包括V171、A172、Y230中的一个或多个。
[0013]SEQ ID NO：1是来源于气单胞菌Aeromonas veronii的野生型亚胺还原酶，经过突变后得到本专利技术的亚胺还原酶突变体，突变点包括V171、A172、Y230中的一个或多个。通过对比催化底物麦思明的活性，突变后的亚胺还原酶的活性是野生型的酶的活性31到50倍。
[0014]所述残基差异包括V171Y/N/A/S、A172V/F、Y230G/A/T中的一个或多个。
[0015]残基差异还包括：S14V/L/D、S33R/G/D/L/A/Q/N、L118V/M、C119/T/D、S130C/T、Q202L/A/S、L206Y/F、I209F/T、K234W/L/F/V、T235L/S、A239Y/L、V277L中的一个或多个。
[0016]亚胺还原酶突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105或107。本专利技术的亚胺还原酶突变体用于制备(S)
‑
尼古丁，在合适的条件下，亚胺还原酶突变体催化底物I
[0017][0018]或底物II
[0019][0020]直接或经过化学反应得到(S)
‑
尼古丁。
[0021]合适的条件是指当底物为麦斯时，将底物I、辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、缓冲液与亚胺还原酶混合后，反应得到化合物III(S)
‑
去甲烟碱。
[0022]优选的，底物I的载量为10g/L至300g/L；酶的浓度为1g/L至10g/L；辅酶的用量为1g/L；葡萄糖脱氢酶的用量为2g/L；pH的范围为6至7；反应的温度为23℃至30℃；反应时间为15小时至24小时。
[0023]优选的，底物I的载量包括10g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L；
[0024]催化底物I使用的酶的浓度为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L。
[0025]催化底物I时的反应温度为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃。
[0026]催化底物I时的反应时间15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时。
[0027]化合物III(S)
‑
去甲烟碱甲基化得到(S)
‑
尼古丁。如(S)
‑
去甲烟碱与甲酸/甲醛反
应得到(S)
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.亚胺还原酶突变体，其特征在于：与氨基酸序列SEQ ID NO：1相比，存在残基差异包括V171、A172、Y230中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述残基差异包括V171Y/N/A/S、A172V/F、Y230G/A/T中的一个或多个。3.根据权利要求1或2所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于：亚胺还原酶突变体的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、105或107。4.一种制备(S)
‑
尼古丁的方法，其特征在于：在合适的条件下，如权利要求1至3任意一项所述的亚胺还原酶突变体催化底物I为化合物III(S)
‑
去甲烟碱，化合物III(S)
‑
去甲烟碱经甲基化得到(S)
‑
尼古丁5.根据权利要求4所述的制备(S)
‑
尼古丁的方法，其特征在于：将底物I、辅酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、缓冲液与亚胺还原酶混合后，反应得到化合物III(S)
‑
去甲烟碱，然后将化合物III(S)
‑
去甲烟碱甲基化得到(S)
‑
尼古丁。6.一种制备(S)
‑
尼古丁的方法，其特征在于：在合适的条件下，如权利要求1至3任意一项所述的亚胺还原酶突变体催化底物II得到(S)
‑
尼古丁，7.根据权利要求6所述的制备(S)
‑
尼古丁的方法，其特征在于：底物II环化后经亚胺还原酶的催化得到(S)
‑
尼古丁；或底物II的盐经脱盐、环化经亚胺还原酶的催化得到(S)
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽聪，
申请(专利权)人：陈泽聪，
类型：发明
国别省市：