甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法，属于生物技术领域。检测试剂盒中包括分别针对甲型流感病毒的MatrixProtein基因、乙型流感病毒的MatrixProtein基因和腺病毒核酸的hexonProtein基因设计得到的引物和探针的组合，还包括用于内标的人Actin基因检测的引物和探针。本发明专利技术的检测试剂盒能够同时有效检测甲、乙型流感病毒和腺病毒，引物和探针针对病原微生物特异性保守序列进行设计，因此检测特异性高；且使用了含有增强剂的PCR反应液，检测灵敏度高；能够为临床提供更可靠的实验证据，满足临床需要。满足临床需要。满足临床需要。

【技术实现步骤摘要】
甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒及使用方法，可用于甲型流感病毒RNA、乙型流感病毒RNA和腺病毒DNA的同时检测。

技术介绍

[0002]流感病毒是一种RNA病毒，属于正黏病毒科，在流感病毒的表面覆盖有一层脂质包膜，脂质包膜上的糖蛋白突起由血凝素(Hemagglutinin，H)和神经氨酸酶(Neuraminidase，N)构成，根据流感病毒核蛋白与基质蛋白抗原性的不同，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型。
[0003]其中，甲型流感病毒(InfluenzaAvirus)最易发生变异，流感大流行往往是由于甲型流感病毒新亚型或旧亚型重现引起的。根据H和N抗原的不同，甲型流感病毒可分为许多亚型，例如H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主多为禽类，但是由于变异，目前在禽流感中也出现了能够直接感染人类的亚型，例如H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8，其中H1N1、H5N1和H7N9尤为值得关注。人类在被甲型流感病毒感染后，症状主要有高热、咳嗽、流涕和肌肉疼痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多个脏器会发生衰竭甚至导致死亡，病死率较高。甲型流感病毒主要通过空气飞沫传播，其次是通过消化道、受损皮肤和眼结膜等多种间接途径传播，传播速度和广度与人口密度有关。甲型流感病毒对人类的威胁较大，曾多次引发世界性大流行，是目前重点监控的呼吸道病毒之一。
>[0004]乙型流感病毒(InfluenzaB virus)也是引起流感的一种主要病毒，人类在被乙型流感病毒感染后的症状与甲型流感病毒相似，但是乙型流感病毒常呈爆发式局限性流行，一般不会引起大流行，并且乙型流感病毒导致的病人住院率仅为甲型流感病毒的1/4左右，因此相对于甲型流感病毒而言，乙型流感病毒对人类的影响不大，但是在临床检验中，需要将其与甲型流感病毒区分开来进行鉴别诊断。
[0005]甲、乙型流感病毒的实验室检测方法通常包括：(1)抗原检测：主要有金标法、酶联免疫法和免疫层析法等，这种检测方法具有检测时间短、灵敏度和特异性较差的特点；(2)培养法：使用鸡胚或MDCK细胞培养法，分离甲、乙型流感病毒，但是检测时间长、阳性率低，因此一般不在临床使用；(3)核酸检测：该方法是目前最重要的检测方法，当前主要使用的是国家流感中心设计的RT
‑
PCR法。
[0006]腺病毒(adenovirus，即呼吸道腺病毒)是一种没有包膜的病毒，由252个壳粒呈20面体排列构成，壳粒中包含线状双链DNA分子。目前发现的腺病毒有100多个血清型，其中腺病毒有52种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群。腺病毒对人体的眼睛、呼吸道、胃肠道、尿道、膀胱和肝脏等均会产生感染，已知腺病毒中1/3的血清型与人类疾病相关。同时，一种血清型可引起不同的临床疾病，不同血清型也可引起同一种疾病。腺病毒引起的呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉疼痛等。腺病毒引起的症状通常难以与其他病毒引起的呼吸道感染相区别，一般包括以下4中不同的综合表现：(1)急性发热性咽喉炎：通常多发于婴儿和儿童，由C组腺病毒引起，多出现咳嗽、鼻塞、发热和咽喉部溃疡等症状；(2)眼结膜热：症状与急性发热性咽喉炎相似，常同时发生结膜炎，多由B组
腺病毒的3、7型所致；(3)急性呼吸道疾病：多出现咽炎、发热、咳嗽和全身不适等症状，多由腺病毒的4、7型引起，也可由3型引起；(4)肺炎：腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10％，多由腺病毒的3、7型引起；青年人的腺病毒肺炎中，病死率为8
‑
10％。
[0007]腺病毒的实验室检测方法通常包括：(1)抗体检测：采取急性期和恢复期双份血清进行检测，恢复期血清抗体效价比急性期增长4倍或以上时，即可诊断；快速抗体检测可用ELISA法或乳胶凝集试验；(2)病毒培养：采集患者咽喉、咽分泌物、粪便和尿液等样本，离心取上清液接种敏感细胞，孵育后观察CPE现象(即病变细胞呈葡萄串状聚集，有拉丝现象)；(3)抗原检测：通常包括免疫荧光和酶免疫分析，与细胞培养相比，免疫荧光的灵敏性提高了40
‑
60％；其他抗原检测方法还包括免疫层析法和乳胶凝集法；另外，还可以用荧光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，并进行血清型分型；(4)DNA杂交或酶切等方法：用于鉴定分离培养的病毒；(5)PCR方法：用于腺病毒感染的诊断，并能检测所有血清型，且敏感性高。
[0008]由此可见，甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒引起的症状较难区分，需要对患者进行鉴别诊断后区别对待。上述检测方法，除了荧光定量技术之外，均存在灵敏度低、耗时长，检测结果易出现假阳性或假阴性等缺点，因此易导致误诊、漏诊。
[0009]荧光探针PCR方法是在反应体系中加入含荧光基团的探针，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，并在最后通过荧光信号对未知模板进行分析的方法。荧光PCR方法简便、快捷，具有良好的检测敏感性和特异性，可用于诊断、疗效判断及流行病学调查，是目前病原感染检测的主要方法。然而当前的荧光探针PCR方法通常每次只能检测一种病原微生物，对于引起症状相似的需要鉴别诊断的甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒检测效果仍相对较低，并且检测灵敏度和特异性也较低，因此需要进一步提高。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于能够同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒，提高临床鉴别诊断的能力，并在检测的同时提高检测灵敏度和特异性。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术公开了一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒，根据甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒中各病原体核酸的保守区域进行设计，得到了分别针对甲型流感病毒的Matrix Protein基因、乙型流感病毒的Matrix Protein基因和腺病毒核酸的hexon Protein基因的核酸检测试剂盒，包括如下引物和探针的组合：
[0012][0013]进一步的，还包括用于内标的人Actin基因检测的引物和探针，用于内标的人Actin基因检测的引物的探针的序列分别为：
[0014]人Actin基因上游引物引物：5
’‑
GATCCCAGAGGTGCATTA
‑3’
；
[0015]人Actin基因下游引物引物：5
’‑
AGTCCTCCAGATCCTTTG
‑3’
；
[0016]人Actin基因探针序列：5
’‑
Cy5
‑
CAAGCCAGTTACCATGAGGAATCC
‑3’
。
[0017]其中，甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒和用于内标的人Actin基因的引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物分别是一组长为16
‑
23nt的碱基序列，Tm值本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲、乙型流感病毒和腺病毒核酸检测试剂盒，用于甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒的同时检测，其特征在于：包括如下引物和探针的组合：2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括用于内标的人Actin基因检测的引物和探针，所述用于内标的人Actin基因检测的引物和探针的序列分别为：人Actin基因上游引物序列：5
’‑
GATCCCAGAGGTGCATTA
‑3’
；人Actin基因下游引物序列：5
’‑
AGTCCTCCAGATCCTTTG
‑3’
；人Actin基因探针序列：5
’‑
Cy5
‑
CAAGCCAGTTACCATGAGGAATCC
‑3’
。3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括PCR增强剂，所述PCR增强剂包括硫酸铵、β
‑
环糊精、Tween20和BSA中的一种或多种的混合物。4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括防污染酶混合液，所述防污染酶混合液包括dUTP、UNG酶、Hotstar DNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂中的一种或多种的混合物。5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括核酸保护剂、含甲型流感病毒Matrix Protein基因的假病毒颗粒、含乙型流感病毒Matrix Protein基因的假病毒颗粒以及含腺病毒hexon Protein基因片段的载体的混合物；所述阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于：所述核酸保护剂包括β
‑
巯基乙醇、二硫苏糖醇和三(2
‑
羧乙基)膦中的一种或多种的混合物。7.一种如权利要求6所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)核酸提取：对临床样本进行核酸提取；(2)预处...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄学文，唐磊，
申请(专利权)人：苏州康唯纳思生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：