针对cANGPTL4的人源化单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及针对血管生成素样4蛋白的C末端(cANGPTL4)的人源化抗体及其用途，例如它们在治疗癌症和癌症治疗方法中的用途。在治疗癌症和癌症治疗方法中的用途。在治疗癌症和癌症治疗方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对cANGPTL4的人源化单克隆抗体
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年4月27日提交的新加坡专利申请号10202003838X的优先权，其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。


[0003]本专利技术涉及针对血管生成素样4蛋白的C末端部分(cANGPTL4)的人源化抗体及其用途，例如它们在治疗癌症和癌症治疗方法中的用途。

技术介绍

[0004]ANGPTL蛋白属于与血管生成素家族成员具有高度相似性的血管生成调节分泌蛋白超家族。ANGPTL4是血管生成素样蛋白家族的成员，并通过不依赖Tie2的机制发挥作用(Zhu,P.,et al.,Angiopoietin
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like 4:a decade of research.Biosci Rep,2012.32(3):p.211
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9)。全长ANGPTL4蛋白经过蛋白酶解加工，以组织和环境依赖性方式生成N末端片段(nANGPTL4)和C末端片段(cANGPTL4)。通过这种翻译后修饰，ANGPTL4已被证明参与能量平衡、伤口修复、肿瘤发生、血管生成、血管通透性调节和氧化还原调节。cANGPTL4通过与特定的基质蛋白、整合素、闭合蛋白、钙粘蛋白和神经纤毛蛋白的相互作用来介导其作用(Sodhi,A.,et al.,Angiopoietin
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like 4binds neuropilins and cooperates with VEGF to induce diabetic macular edema.J Clin Invest,2019.129(11):p.4593
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4608；Huang,R.L.,et al.,ANGPTL4 modulates vascular junction integrity by integrin signaling and disruption of intercellular VE
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cadherin and claudin
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5clusters.Blood,2011.118(14):p.3990
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4002；Goh,Y.Y.,et al.,Angiopoietin
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like 4interacts with integrins beta1 and beta5 to modulate keratinocyte migration.Am J Pathol,2010.177(6):p.2791
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803；Goh,Y.Y.,et al.,Angiopoietin
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like 4interacts with matrix proteins to modulate wound healing.J Biol Chem,2010.285(43):p.32999
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3009)。与cANGPTL4结合并干扰cANGPTL4与其各种相互作用配偶体之间的相互作用的mAb可以减弱或消除cANGPTL4在各种疾病中的功能。
[0005]针对cANGPTL4的鼠抗体已在国际专利公布WO2014/027959A1中公开。
[0006]最近对抗体疗法的兴趣和进展为将抗体工程改造成多种人类病状的治疗和诊断提供了基础。抗体在改善疾病方面的潜力可以说是有益的，其副作用比传统化疗或长期用药少，这对于恢复时间来说是有利的。
[0007]目前，有四类单克隆抗体(mAb)可用：鼠、嵌合、人源化和人mAb，每种都有其优点和缺点。鼠mAb通常通过传统的杂交瘤技术产生，即给小鼠注射特定的抗原，将分离的脾细胞与突变的骨髓瘤系融合，然后选择分泌单克隆抗体到培养上清液中的杂交瘤。对于嵌合mAb，使用与鼠单克隆相同的技术产生杂交瘤，但将编码鼠抗体重链和轻链可变区的基因以及人重链和轻链恒定区的基因插入质粒，然后将其转染到细菌中，用于随后产生嵌合抗体作为包涵体。
[0008]然而，鼠抗体和嵌合抗体具有人抗鼠抗体(HAMA)反应并发症的缺点。在人中，鼠mAb经常被宿主排斥，因为免疫系统认为这些mAb是外来的，因此，由于mAb因不良免疫反应而具有较短的半衰期以及免疫复合物形成的副作用，所以用抗体进行长期治疗变得无效。即使用人抗体(如嵌合mAb)代替大部分非抗原结合部分，HAMA反应仍然存在，这通常会引起类似的本质上是免疫原性的副作用，尽管不如鼠mAbs严重。
[0009]为了克服上述问题，已开发出人源化抗体，该抗体允许通过互补决定区(CDR)移植使HAMA反应最小化。通过将6个鼠CDR与人可变区和恒定区基因一起移植到表达载体中并在哺乳动物细胞中表达它们，就可以生产人源化mAb。该技术允许抗体具有几乎类似于人抗体的特性，这大大降低了鼠mAb和嵌合mAb的免疫原性，因此延长了用于慢性治疗的人源化mAb的半衰期，这反而允许不经常进行干预。
[0010]涉及CDR移植的过程需要各种设计选择，例如确定CDR的边界、使用哪些人骨架以及鼠mAb的哪些残基(如果有的话)替代到人骨架区中。已经发现该设计并不简单并且不能保证成功，因为必须保留亲本抗体的结合强度和特异性以及抗体稳定性，同时要减少或去除人中不希望的免疫原性特性。此外，需要实现稳定形式的抗体的重组生产。
[0011]即使有必要的步骤来将鼠mAb转化为人源化抗体，人源化mAb的警告仍然有可能影响后期人临床研究和后续治疗的治疗效果，甚至导致严重的副作用。一个问题可能源于CDR环的转移不足，与原始mAb构建体相比，这可能会影响结合亲和力保留，因为可变残基和恒定残基的人骨架会影响环的取向(George,A.J.T.and C.E.Urch,Diagnostic and therapeutic antibodies.Methods in molecular medicine.2000,Totowa,N.J.:Humana Press.xiv,477p.)，并且可能需要进一步改变以及通过体内测试确认以充分确定人源化mAb的特异性、亲和力和下游免疫原性副作用(如果有的话)。
[0012]这些问题阻碍了开发，因此迄今为止尚未提出针对cANGPTL4的人源化阻断单克隆抗体。

技术实现思路

[0013]本专利技术满足了这种需要，并且在本专利技术的第一方面，提供了针对血管生成素样4蛋白的C末端区(cANGPTL4)的人源化抗体，所述人源化抗体包含具有人骨架区的重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO.1
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3所示的氨基酸序列的鼠V
H CDR1、V
H CDR2和V
H CDR3区，所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO.4
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6所示的氨基酸序列的鼠V
L CDR1、V
L CDR2和V
L CDR3区，其中：
[0014](1)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：7(ANGH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.针对血管生成素样4蛋白的C末端区(cANGPTL4)的人源化抗体，所述人源化抗体包含具有人骨架区的重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含具有SEQ ID NO.1
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3所示的氨基酸序列的鼠V
H CDR1、V
H CDR2和V
H CDR3区，所述轻链可变结构域包含具有SEQ ID NO.4
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6所示的氨基酸序列的鼠V
L CDR1、V
L CDR2和V
L CDR3区，其中：(1)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：11(ANGH3)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：11(ANGH3)所示的氨基酸序列或其变体组成，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12(ANGK3)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：12(ANGK3)所示的氨基酸序列或其变体组成；或者(2)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：7(ANGH1)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：7(ANGH1)所示的氨基酸序列或其变体组成，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8(ANGK1)、10(ANGK2)或12(ANGK3)中任一个所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：8(ANGK1)、10(ANGK2)或12(ANGK3)中任一个所示的氨基酸序列或其变体组成；(3)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：9(ANGH2)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：9(ANGH2)所示的氨基酸序列或其变体组成，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8(ANGK1)、10(ANGK2)或12(ANGK3)中任一个所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：8(ANGK1)、10(ANGK2)或12(ANGK3)中任一个所示的氨基酸序列或其变体组成；(4)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：11(ANGH3)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：11(ANGH3)所示的氨基酸序列或其变体组成，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8(ANGK1)或10(ANGK2)中任一个所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ IDNO：8(ANGK1)或10(ANGK2)中任一个所示的氨基酸序列或其变体组成；或者(5)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：13(ANGH4)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：13(ANGH4)所示的氨基酸序列或其变体组成，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或其变体组成；其中所述变体对于SEQ ID NO.1
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6中定义的CDR区是不变的并且与各参照序列具有至少80％的序列同一性。2.根据权利要求1所述的抗体，其中(1)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：7(ANGH1)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：7(ANGH1)所示的氨基酸序列或其变体组成，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8(ANGK1)、10(ANGK2)或12(ANGK3)中任一个所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：8(ANGK1)、10(ANGK2)或12(ANGK3)中任一个所示的氨基酸序列或其变体组成；(2)所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：9(ANGH2)所示的氨基酸序列或其变体或由SEQ ID NO：9(ANGH2)所示的氨基酸序列或其变体组成，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8(ANGK1)或12(ANGK3)中任一个所示的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈源顺，
申请(专利权)人：南洋理工大学，
类型：发明
国别省市：