含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法技术

本发明专利技术的课题是提供一种血管再生能力高且引发炎症的可能性低的含有成熟脂肪细胞的组合物。本发明专利技术的解决手段是一种含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法，其包含：切割过滤工序，其将未进行酶处理的脂肪组织进行切割过滤，而获得微小脂肪；微小脂肪培养工序，其在切割过滤工序后，使用培养用培养基培养微小脂肪，而获得成熟脂肪细胞；以及含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序，其获得含有成熟脂肪细胞的组合物，所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含成熟脂肪细胞及经过微小脂肪培养工序所得到的条件培养基，并且，培养用培养基为包含自体血清的培养基，或为包含FBS、氢化可的松及FGF

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法


[0001]此专利技术涉及含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法。更详细而言是涉及包含成熟脂肪细胞及条件培养基(例如成熟脂肪细胞的上清液)的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法，其可提高移植用脂肪组织的血管再生并提高脂肪移植的植活率。

技术介绍

[0002]乳癌切除后所进行的作为乳房重建手术的脂肪移植被认为是不会促进癌转移且安全的。因此，在整形外科及美容外科的领域中频繁地进行乳房重建手术。但是，乳房的组织量非常庞大，因此至今为止即使将吸取活体的脂肪组织所获得的脂肪组织片进行移植，也只能获得30
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45％的植活率(Zhou人等，非专利文献1)。
[0003]在受体环境中的吸取脂肪组织片的生存率低的主要原因是没有供养血管。经移植的脂肪组织片因为从原本的供养血管分离，所以会营养不良而坏死。已知脂肪组织片在移植后会被认作为异物，而会发生吸收、囊肿形成、钙化。接下来，作为提高植活率的方法，已报导将脂肪组织和脂肪源性干细胞(ASC)一起移植的方法(cell
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assisted lipotransfer，细胞辅助脂肪移植:CAL(Eto人等，非专利文献2))，所述脂肪源性干细胞存在于基质血管部分中的SVF(small vascular fraction，基质血管组分)，所述基质血管部分存在于脂肪组织的血管周围。此方法是将吸取脂肪组织进行酶处理并去除脂肪成分，而获得血管周围中的细胞、SVF脂肪祖干细胞，并和吸取脂肪组织一起移植的方法。SVF的特征为进行自体再生的能力高及具有多能性(Zuk PA人等，非专利文献3)。
[0004]Zhou人等在系统评估中系统性评论了包含387件案件的17篇文章(Zhou人等，非专利文献1)。比起单独吸取脂肪移植组，CAL组的脂肪生存率明显较高(60％对45％，p＝0.0096)。CAL大幅改善脸部的脂肪生存率(19％)，并减少多次手术的发生率(13.6％)。但是，在乳房脂肪移植中，仅改善9％的脂肪生存率，没有统计学上的意义。
[0005]另一方面，相较于脸部病例，乳房病例的CAL：Cell assisted liptransfer，细胞辅助脂肪移植技术(Eto人等，非专利文献2))的并发症的发生率较高(p<0.001)。CAL是利用将脂肪组织进行酶处理而获得基质血管组分(SVF:small vascular fraction)中所存在的脂肪源性干细胞(ASC)，并将使血管再生的细胞ASC及脂肪组织一起移植的方法。大多数的CAL会发生移植脂肪的吸收而以失败告终。作为其原因，被认为是经移植的脂肪组织会从原本的供养血管分离，因此虽然会残留一部分(300微米以下的脂肪)，但大多会营养不良而坏死。
[0006]至今为止，作为成功的血管再生用细胞，已开发有脂肪祖细胞，即脂肪干细胞(ASC)，以及去分化脂肪细胞(DFAT)这两种。
[0007]ASC为脂肪祖细胞，不仅会分化成脂肪细胞，也是具有分化成骨细胞、肌肉细胞、软骨细胞等的多分化能力的干细胞(ZukPA人等，非专利文献3)。并且，因为有促进癌转移的报告，所以不适合在乳癌切除后的乳房重建手术中频繁地进行。并且，ASC因为在低氧下会诱导大量的TNF
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α，所以有可能引起炎症，因为无法抑制由移植后的炎症诱发所造成的吸收，
所以不适合于移植。
[0008]并且，DFAT细胞诱导血管的因子尚未被特定，其机制的不明确性也是阻碍其适应人类的原因。
[0009]现有技术文献
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Zhou Y,Wang J,Li H,et al.Efficacy and Safety of Cell
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Assisted Lipotransfer:A Systematic Review and Meta
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Analysis.Plast Reconstr Surg 2016:137:44e
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57e.
[0012]非专利文献2:Eto H,et al.:The fate of adipocyte after non vascularized fat grafting:Evidence of early death and replacement of adipocytes.Plast Reconstr Surg.2012；129(5):1081
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92.
[0013]非专利文献3:Zuk PA.et al.:Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.Mol Biol Cell 2001；13:4279
‑
95.

技术实现思路

[0014]专利技术所欲解决的课题
[0015]有鉴于上述背景，期望血管再生能力高的含有成熟脂肪细胞的组合物。并且，期望引起炎症的可能性低的含有成熟脂肪细胞的组合物。
[0016]再者，期望包含如上述般的含有成熟脂肪细胞的组合物的血管再生促进剂、能使用作为皮下脂肪组织的替代品的组合物、用于乳房增大手术、乳房重建手术或组织凹陷成形手术用的含有脂肪的剂。
[0017]解决课题的技术手段
[0018]本专利技术基本上是基于由下述实施例所得的发现，所述实施例是将脂肪组织进行切割过滤并使用培养基培养微小脂肪而获得成熟脂肪细胞，且同时，包含此培养时所获得的条件培养基(培养上清液)的组合物会包含大量IL
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8、GRO、MCP
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1或VEGF(血管内皮细胞生长因子)等会促进血管形成的趋化因子/细胞因子，若使用此组合物，则会非常顺利地进行例如乳房重建手术。
[0019]此说明书所记载的第一专利技术涉及含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法。此方法包含切割过滤工序、微小脂肪培养工序及含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序。
[0020]切割过滤工序是用于将未进行酶处理的脂肪组织进行切割过滤而获得微小脂肪的工序。
[0021]微小脂肪培养工序是用于在切割过滤工序后使用培养用培养基而培养所述微小脂肪并获得成熟脂肪细胞的工序。培养用培养基包含氢化可的松及FGF
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2。
[0022]含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序是用于获得含有成熟脂肪细胞的组合物的工序，所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含所述成熟脂肪细胞及经过所述微小脂肪培养工序所得到的条件培养基(conditioned medium)。
[0023]脂肪组织的优选例是已在清洗吸取脂肪后去除血液成分的脂肪组织。
[0024]切割过滤工序的优选例包含进行离心分离并去除沉淀的基质血管组分(SVF)的工序。
[0025]成熟脂肪细胞的优选例是相较于IL
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6使趋化因子/细胞因子，即IL
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8、GRO、MCP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法，其特征在于，包含：切割过滤工序，其将未进行酶处理的脂肪组织进行切割过滤，而获得微小脂肪；微小脂肪培养工序，其在切割过滤工序后，使用培养用培养基培养所述微小脂肪，而获得成熟脂肪细胞；以及含有成熟脂肪细胞的组合物取得工序，其获得含有成熟脂肪细胞的组合物，所述含有成熟脂肪细胞的组合物包含所述成熟脂肪细胞及经过所述微小脂肪培养工序所得到的条件培养基(conditioned medium)，所述切割过滤工序包含进行离心分离而去除沉淀的基质血管组分(SVF)的工序，所述培养用培养基为包含氢化可的松及FGF
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2的培养基。2.根据权利要求1所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法，其特征在于，所述脂肪组织是已在清洗吸取脂肪后去除血液成分的脂肪组织。3.根据权利要求2所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法，其特征在于，所述切割过滤工序还包含将通过离心分离所得的漂浮于液相的上部的脂肪成分进行回收而获得所述微小细胞的工序。4.根据权利要求3所述的含有成熟脂肪细胞的组合物的制造方法，其特征在于，所述条件培养基(conditioned medium)分别包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：矢永博子，矢永茄津，
申请(专利权)人：医疗法人矢永诊所，
类型：发明
国别省市：