低生物碱含量的烟草属植物体及其制备方法技术

本发明专利技术的一个实施方式提供低生物碱含量的烟草属植物体。在烟草属植物体中，编码天冬氨酸氧化酶AO2的基因的功能受到了抑制。氨酸氧化酶AO2的基因的功能受到了抑制。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】低生物碱含量的烟草属植物体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及低生物碱含量的烟草属植物体及其制备方法。

技术介绍

[0002]以往，作为对烟草(红花烟草(Nicotiana tabacum))带来低生物碱性的自然突变的基因座，已知有Nic1及Nic2基因座。在两个基因座分别存在与尼古丁生物合成相关的若干转录因子等的基因。在尼古丁减少的nic1突变体及nic2突变体中，在基因组中存在很大的缺失，它们的基因从基因组上消失。在两个基因座均以纯合方式具有突变的情况下，尼古丁含量达到一般的烟草品种(15～45mg/g)的10％左右(2
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4.5mg/g干叶)(非专利文献1)。目前为止，报告了各种使烟草中的尼古丁等生物碱含量降低的研究。例如，非专利文献1中总结了基于尼古丁的生物合成体系的酶QPT、PMT、BBL的基因的功能抑制而得到低尼古丁烟草的制备例，这些基因的功能受到了抑制的烟草中的尼古丁含量分别为1.4mg/g干叶、0.6
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2.2mg/g干叶、4.1
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4.4mg/g干叶。在这些基因当中，也包括因抑制表达而发生畸形的基因(QPT)(非专利文献2)。另一方面，报告了在PMT的功能受到了抑制的烟草中，效果最好的品系中尼古丁含量较对照减少了96.7％，即降低至对照的3.3％(非专利文献3)，此外，还报告了在BBL的敲除品系中尼古丁含量减少至对照的0.3％(非专利文献4)。但是，在这些报告中，尽管尼古丁减少效果明显，但需要将烟草基因组中存在的5个PMT全部进行功能抑制，而且需要将烟草基因组中存在的6个BBL全部敲除，因此，在实际进行育种方面存在很大的障碍。
[0003]非专利文献5及非专利文献6中报告了对属于烟草属的植物中与生物碱的生物合成相关的各种基因及其表达进行研究的结果，表明在属于烟草属的植物中存在AO1及AO2这2个天冬氨酸氧化酶(AO)基因，AO1在植物体整体普遍性表达，AO2在根特异性地表达。AO是通过催化天冬氨酸的氧化而生成亚氨基天冬氨酸的酶。AO是参与烟酸及烟酰胺的代谢的生物体内的重要的酶。
[0004]专利文献1中记载了通过与NBB1或A622基因组合将尼古丁生物合成酶基因(包含AO基因)调节为较低水平，从而使生物碱含量减少。专利文献2中记载了通过利用基因组编辑技术使尼古丁生物合成基因(包含AO基因)的表达降低，从而减少尼古丁类似生物碱。但是，在专利文献1及2中，实际上没有对AO基因进行处理的实验结果，而且也没有区分AO1和AO2。
[0005]另外，最近，在烟草中，在作为对尼古丁生物合成酶基因簇进行正向调节的转录因子的ERF189及ERF199这2个基因的敲除品系中，显示出生物碱含量降低至对照的2～4％(非专利文献7)。在该品系中，处于ERF189及ERF199控制下的多个尼古丁生物合成系基因簇、例如PMT、AO2的表达量减少至对照的3％左右(不会变为零)。但是，转录因子的敲除会影响各种基因簇的转录，抑制多个基因的功能，存在对植物的代谢途径造成影响的隐患。实际上，该品系中显示出碳(C)/氮(N)比的平衡被破坏。
[0006]需要说明的是，已知在烟草以外的植物中，AO基因的功能破坏会导致对生物体的

技术实现思路

[0021]专利技术要解决的课题
[0022]以往，虽然已知低生物碱含量的烟草，但为了实现极低(例如野生型的5％以下)的尼古丁含量，需要多个基因的突变或表达抑制。另外，只要抑制基因的功能，有时就会伴有产生不期望的性状(例如，畸形及早期老化等障碍)的问题。即，迄今为止，还没有通过一个或两个的少量酶基因的突变而制备出尼古丁含量极低的烟草属植物体的例子。
[0023]本专利技术的一个实施方式是鉴于上述课题而完成的，其主要目的在于提供少量(一个或两个)的基因通过该基因中的内源性突变而使功能受到了抑制的具有低生物碱含量的烟草及其制造方法。
[0024]解决课题的方法
[0025]为了解决上述的课题，本申请专利技术人等进行了深入研究，结果首次发现，通过在烟草属植物体中利用AO2基因中的内源性突变抑制编码AO2的基因的功能，该烟草属植物体的生物碱含量降低，所述AO2为根特异性天冬氨酸氧化酶。即，发现了：在作为二倍体的烟草属植物(林烟草)中通过1个AO2基因的突变、在作为双二倍体的烟草属植物(红花烟草)中通过2个AO2基因(AO2
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S和AO2
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T)的突变，生物碱含量变得极低(低于对照的5％)；另外，在作为双二倍体的烟草属植物(红花烟草)中，通过AO2
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S基因或AO2
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T基因的突变、即一个AO2基因的突变，尼古丁含量变为一半以下，从而完成了本专利技术。
[0026]即，本专利技术的烟草属植物体在基因组中的以下至少一个内源基因中导入了特异性地引起该内源基因的功能抑制的突变，所述内源基因为：(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。
[0027]本专利技术的低生物碱含量的烟草属植物体的制备方法包括：在烟草属植物体的基因组中导入特异性地引起以下至少一个内源基因的功能抑制的突变的工序，所述内源基因为：(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因，上述进行导入的工序包括在上述内源基因中导入上述突变。
[0028]专利技术的效果
[0029]根据本专利技术，可以提供生物碱含量降低的烟草。
附图说明
[0030]图1是示出SNIC品系的F1个体的降烟碱检测结果的图。
[0031]图2是示出林烟草(N.sylvestris)的2个AO基因(NsAO1、NsAO2)的表达曲线的图(RNA
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seq数据。单位为FPKM：Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped reads)。
[0032]图3是示出烟草(Nicotiana)属AO的氨基酸序列的分子系统树的图。收集基于UPGMA法。Nsyl AO2_ptn、Ntab AO2
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S ptn、Ntab AO2_T_ptn分别表示由本专利技术中确定的NsAO2、NtAO2
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S、NtAO2
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T基因翻译的氨基酸序列。Nsyl表示林烟草(N.sylvestris)，Ntab表
示红花烟草(N.tabacum)，Ntom表示绒毛状烟草(N.tomentosiformis)，Natt表示渐狭叶烟草(N.attenuata)。以XP开始的编号为GenBank Accession编号。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种烟草属植物体，其在基因组中的以下至少一个内源基因中导入了特异性地引起该内源基因的功能抑制的突变，所述内源基因为：(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。2.根据权利要求1所述的烟草属植物体，其中，所述功能抑制为：与野生型植物相比，由所述内源基因生成的mRNA的存在量减少。3.根据权利要求2所述的烟草属植物体，其中，所述功能抑制为：与野生型植物相比，由所述内源基因生成的mRNA的分解受到促进。4.根据权利要求2所述的烟草属植物体，其中，所述功能抑制为：与野生型植物相比，来自所述内源基因的mRNA的转录量减少。5.根据权利要求1～4中任一项所述的烟草属植物体，其中，所述功能抑制为：与野生型植物相比，所述多肽的存在量减少。6.根据权利要求5所述的烟草属植物体，其中，所述功能抑制为：与野生型植物相比，所述多肽的翻译量减少。7.根据权利要求1～6中任一项所述的烟草属植物体，其中，通过突变原处理、基因组编辑或基因敲除导入了所述突变。8.根据权利要求1～7中任一项所述的烟草属植物体，其属于红花烟草、林烟草或黄花烟草。9.根据权利要求1～8中任一项所述的烟草属植物体，其中，以下内源基因没有发生功能抑制：(c)包含编码相对于序列号62或序列号63所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(d)包含编码相对于序列号64所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。10.一种烟草属植物体的制备方法，该方法包括：在烟草属植物体的基因组中导入特异性地引起以下至少一个内源基因的功能抑制的突变的工序，所述内源基因为：(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因，进行所述导入的工序包含在所述内源基因导入所述突变。11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述功能抑制为：与野生型植物相比，由所述内源基因生成的mRNA的存在量减少。12.根据权利要求11所述的制备方法，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：竹内贵规，新井雅雄，宇田川久史，真笼洋，西口辽，高仓由光，
申请(专利权)人：日本烟草产业株式会社，
类型：发明
国别省市：