一种表达外源hTRX1的增强型间充质干细胞及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种表达外源hTRX1的增强型脐带间充质干细胞及其制备方法和用途。所述脐带间充质干细胞可瞬时表达外源hTRX1，其制备方法包括使用可瞬时表达hTRX1的腺病毒载体感染所述间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞可用于组织损伤修复、移植物抗宿主病的治疗、自身免疫性疾病的治疗或者作为基因治疗的载体。身免疫性疾病的治疗或者作为基因治疗的载体。身免疫性疾病的治疗或者作为基因治疗的载体。

【技术实现步骤摘要】
一种表达外源hTRX1的增强型间充质干细胞及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及细胞治疗领域，更具体地，本专利技术涉及一种经修饰的间充质干细胞及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]人体组织细胞受电离辐射后，细胞生成并释放多种氧自由基和活性氧 (reactive oxygen species,ROS)，同时抗氧化酶的作用减弱，导致DNA碱基缺失、双链断裂、与蛋白质交联等多种类型损伤；其次，自由基可使生物膜发生脂质过氧化，膜的通透性增加，导致膜的结构及功能受损，甚至发生膜崩解。同时，ROS使蛋白质紧密结构变得松散，疏水性、顺磁性、紫外吸收光谱等物理性质的改变，并易于被蛋白水解酶水解。最后，细胞结构及功能的损伤，进一步诱导细胞凋亡的发生。2007年Lambeth研究证明，细胞通过NADPH氧化酶(NOXs)产生ROS，进一步研究发现，NOX4在电离辐射后的造血干细胞 (HSCs)重表达上调，可能主要介导HSC中的ROS产生。Wang等研究发现，亚致死剂量辐射处理的小鼠体内ROS持续增加，使用抗氧化剂可以显著降低细胞氧化损伤和辐射诱导的HSCs克隆形成抑制。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是目前在组织损伤修复领域中应用范围最广的成体干细胞。1976年Friedenstein和Petrakova首次报道，通过贴壁培养的方法从骨髓中分离出MSC，MSC是中胚层来源的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力，既可向成脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、心肌细胞、基质细胞、内皮细胞、肝和胆道上皮细胞、肺上皮细胞等中胚层细胞分化，亦可向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆细胞分化。同时，MSC能产生一些造血及非造血生长因子、白介素和趋化因子，如 G
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CSF、LIF、M
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CSF、FLT
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3配体、SCF、IL
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6、IL
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11、IL
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12、TPO、IL
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15和 TNF
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α等，此外，其还可分泌大量粘附分子。这些细胞因子在造血干细胞的增殖、分化及归巢中发挥重要作用。此外，MSC本身还可能通过以下机制修复损伤器官：
①
MSC通过分泌多种生长性细胞因子，促进细胞增殖；
②
MSC在损伤局部促进新生血管生成；
③
分泌细胞因子，调剂机体/局部免疫反应；此外，MSC 具有重建造血微环境、低免疫源性、免疫调节、易于外源基因转染和表达等特点。
[0004]MSC已经开展的临床试验，主要包括：1、组织损伤修复；2、移植物抗宿主病的治疗；3、自身免疫性疾病；4、作为基因治疗的载体等。已经有多款间充质干细胞药物获批上市，我国也批准了多项间充质干细胞的临床试验。
[0005]大量研究表明，MSC在促进造血恢复和延长HSC移植患者生存期等方面是安全有效的。放射诱发的肺损伤(RILI)是胸部肿瘤放射治疗中的常见并发症， RILI通过复杂的病理过程发展，导致多种细胞因子的诱导和激活，炎性细胞浸润，细胞因子诱导的成纤维细胞活化以及随后的活化成纤维细胞组织重塑，最终导致肺功能受损和呼吸衰竭。越来越多的证据表明，MSC可能在调节炎症和免疫反应，促进受损的驻留细胞的存活和修复以及通过可溶性旁分泌因子和治疗性细胞外囊泡促进受损组织的再生中起主要作用。
[0006]MSC易于外源基因转染和表达，且具有向照射后受损组织聚集的生物学特性。Cheng等研究发现，在大鼠心梗模型中，与单纯输注骨髓MSC相比，CXCR4 修饰的MSC在梗死心肌内及周围大量聚集，并改善了心功能。利用趋化因子受体CCR1修饰的MSC也出现了类似的结果。啮齿动物心肌梗死模型研究证明，除了增加损伤区的归巢率，CXCR4和SDF1双重修饰的MSC还增加了血管生成和生长因子的表达，改善了血管内皮分化和血管生成，从而提高了心功能。 Mangi等研究发现，应用反转录病毒作为载体，将抗凋亡信号蛋白Akt修饰的 MSCs移植到大鼠梗死的心肌内，可明显减少梗死心肌面积，抑制心室重构，提高左室射血功能。其作用机制可能与促进抗炎症因子和促修复因子的表达有关。通过使用抗凋亡因子bcl
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2、血红素加氧酶
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1(HO
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1)、血管生成素和肝细胞生长因子等来修饰MSC，来抑制其过早凋亡，提高抗缺氧能力，修复心肌细胞和促进血管生成，并改善心功能。
[0007]硫氧还蛋白(Trx)系统由NADPH、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和硫氧还蛋白组成，通过其二硫还原酶活性调节蛋白质二硫醇/二硫平衡，是抵御氧化应激的关键抗氧化系统。人硫氧还蛋白(hTRX1,thioredoxin)是一种12kDa的多功能蛋白，具有保守的氧化还原催化位点(
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Cys
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Gly
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Pro
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Cys
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)，与其他抗氧化剂如SOD 和N
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乙酰半胱氨酸不同，hTRX1不但有强烈的清除体内过氧化物，保护细胞免受诸如肿瘤坏死因子(TNF)以及H2O2等损伤，而且其还具有抑制凋亡和促进细胞生长的作用，有利于受损伤组织的修复。此外，hTRX1能清除活性氧中间物，从而保护细胞免受细胞毒作用。研究发现，hTRX1通过清除自由基，减少活性氧来抑制脂质过氧化的产生，从而减轻缺血/再灌注引起的肺损伤。hTRX1 通过抑制凋亡信号调节激酶Ⅰ和caspase
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3样蛋白酶的活性来抑制细胞凋亡。通过提高细胞对自身分泌的生长因子的敏感性来促进细胞增殖。hTRX1能减轻肺及脑组织再灌注损伤。此外，hTRX1也是一种应激诱导蛋白，在各种因素的刺激下其表达增强，如病毒感染、暴露于紫外线、X线照射和过氧化氢。提示其在病毒感染及急性辐射损伤中发挥重要作用。Yagi等研究发现，在犬肺移植再灌注损伤模型中，hTRX1治疗组(30mg/kg)与半胱氨酸治疗组(150mg/kg)均具有清除自由基的作用，减轻肺的缺血/再灌注损伤，起到保护移植肺的作用。Hoshino等研究发现，重组人hTRX1通过调节炎症反应可减轻由博来霉素或炎症因子IL
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2和IL
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18引起的小鼠间质性肺炎和肺纤维化。在脂多糖(LPS)诱导的大鼠肺损伤模型中，静脉连续给予重组hTRX1通过抗趋化作用来抑制支气管中性粒细胞浸润。另有研究表明，ROS可能通过抑制TRX1介导细胞自噬，促进细胞凋亡进程。Chen等发现，hTRX1通过减少ROS生成、提高抗氧化活性和调节MAPK和PI3K
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Akt信号通路，显著减轻高氧诱导的肺泡上皮细胞损伤。
[0008]MSC有多种来源，其中骨髓来源的MSC研究的最多且最为深入，Zhang等研究提示过表达TRX1上调了超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平，下调了ROS的产生，从而提高了骨髓MSC抵抗高氧诱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强型间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞中包含可以瞬时表达外源hTRX1的载体，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。2.如权利要求1所述的增强型间充质干细胞，其中所述载体是腺病毒载体。3.如权利要求2所述的增强型间充质干细胞，其中所述腺病毒载体是AdMax载体系统，优选地为Ad5腺病毒载体，更优选地为Ad5F35腺病毒。4.如权利要求1
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3中任一项所述的增强型间充质干细胞，其中所述间充质干细胞是体外培养的脐带间充质干细胞，更优选地，是体外培养至P2代、P3代、P4代或P5代的脐带间充质干细胞5.一种增强型间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括使用可瞬时表达hTRX1的腺病毒载体感染所述间充质干细胞，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下...

【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，杨杨，赵龙，田宠，盛宏霞，夏丽，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第五医学中心，
类型：发明
国别省市：