一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质分离专用固定相的制备方法，本申请中，常见的廉价鸡蛋白、鸭蛋白等蛋白被键合在甲基丙烯酸缩水甘油酯

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用

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[0001]本专利技术涉及色谱分离固定相
，具体地说，是一种蛋白分离专用固定相的制备方法及其应用。

技术介绍
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[0002]蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命生长发育的各个阶段都起着很重要的作用。进行蛋白的高效率和高灵敏度的分离和分析研究是现代药物分析、分析化学及生命科学研究的热点领域之一。到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。因此，发展多元化的适用于蛋白分离的固定相显得尤为重要。
[0003]蛋白键合类固定相具有独特的三维结构，这种立体选择性使得其在蛋白分离过程中呈现出独特的分离效果，因而成为在色谱分离蛋白中极具吸引力的固定相之一。目前，已有多种蛋白键合色谱固定相，如牛血清白蛋白(高等化学学报，2002,7:1251～1254)、人血清白蛋白(中国专利技术专利CN 103623796A)等，已经商品化的如ChromTech公司的α1
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酸性糖蛋白柱。但是这类固定相多以硅胶为基质，硅胶pH耐受范围为2～8，而流动相pH和有机相比例都对蛋白分离影响甚巨，这无疑在蛋白分析方法建立的过程中极大的限制了分离模式的选择。此外，此类蛋白柱普遍存在样品容量小、价格昂贵等现象，不适用于规模化的制备。
[0004]甲基丙烯酸缩水甘油酯
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二乙烯基苯共聚物微球(GMA
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DVB)具有pH耐受范围广，机械强度高、溶胀系数小等特点，能够在较极端的pH环境下保持良好的性能，也能够耐受较高压力，很适合用作蛋白分离固定相的基质，且其表面含有丰富的环氧基，易于蛋白键合等改性修饰。GMA
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DVB合成方法较为成熟，成本相对较低，在其表面进行合适的改性使其适用于蛋白分离，可以极大的降低蛋白分离固定相的成本，从而让其用于规模化的制备成为可能。

技术实现思路
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[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛋白分离专用固定相的制备及其应用。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007]一种蛋白分离分离专用固定相的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤为：
[0008](1)GMA
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DVB聚合物微球的平衡：将0.1～10g聚合物微球分散于10～50mL的磷酸二氢钾
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磷酸氢二钾缓冲溶液(0.1～0.5mol/L，pH 7.0～8.0)中，于20～40℃下震荡10～20min后静置1～2h，优选为1h，过滤后固体产物中加入10～50mL，优选为40mL磷酸二氢钾
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磷酸氢二钾缓冲溶液(0.01～0.1mol/L，pH 7.0～8.0)；
[0009](2)乳清蛋白的键合：将1～10g蛋清溶解于10～50mL质量浓度为0.5～1.5％的氯化钠溶液中，过滤残渣，待步骤(2)中聚合物微球与缓冲溶液平衡0.5～1h，优选为1h后，将配制好的蛋清溶液加入其中，在20～30℃，优选为30℃下，以100～200r/min速率震荡12～24h；
[0010](3)：材料的清洗干燥：用质量浓度为0.5～1.5％氯化钠水溶液清洗掉未反应蛋白后，依次分别用水和甲醇洗涤1～5次后，产物于50～60℃干燥12～24h，得到蛋白分离专用固定相。
[0011]步骤(1)中，所述的聚合物微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯
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二乙烯基苯共聚物(GMA
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DVB)微球。
[0012]步骤(1)中，所述GMA
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DVB聚合物微球的制备方法：于三口烧瓶中加入1.0～2.0g的聚苯乙烯乳液和20～30mL质量浓度0.1～0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，同时于一烧杯中加入20～50mL的质量浓度0.1～0.5％的SDS溶液和5～10mL的邻苯二甲酸丁酯(DBP)，将烧杯中的溶液超声乳化至表面无油滴后加入到三口烧瓶中，于机械搅拌50～100rpm，水浴20～50℃条件下反应20～24h。
[0013]称取1.0～5.0g过氧化苯甲酰(BPO)、10～20mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、10～20mL二乙烯基苯(DVB)和20～50mL甲苯于一个烧杯中，于另一个烧杯中加入1～3g的SDS和200～500mL的聚乙烯醇(PVA,wt％,1～5％)，搅拌溶解，将第一个烧杯中的溶液倒入另一个烧杯中进行超声乳化，至表面无油滴后加入到上述三口烧瓶中，继续在水浴20～50℃条件下反应20～24h。将反应体系的温度升至70～90℃，氮气保护下继续反应20～24h。反应溶液抽滤，残余固体用热水洗涤至无泡沫后转移至20～40mL无水乙醇中，超声分散后抽滤，得到GMA
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DVB的基球粗品。将GMA
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DVB的基球粗品分散于二氯甲烷溶液中，搅拌20～24h后抽滤，残余固体重新分散于20～40mL无水乙醇中沉降，重复沉降1～3次后于50～60℃的烘箱中干燥12～24h，得GMA
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DVB微球。
[0014]步骤(2)中，所述蛋清溶液为鸡蛋清、鸭蛋清中的一种或者是两者的混合溶液。
[0015]步骤(2)中，所述蛋清和聚合物微球的质量比为1:0.1～1:5,优选为1:1。
[0016]所制备的蛋白分离专用固定相可以被装填到色谱柱中，完成蛋白质的分离分析和制备。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的积极效果是：
[0018]本专利技术制备得到的蛋白分离专用固定相将廉价易得的鸡蛋白、鸭蛋白等蛋白键合在聚合物微球基质上，依“相似相亲”原理实现分离，再者由于键合的蛋白质非单一组分，因此对待测蛋白具有特殊的分离选择性和优异的样品负载量。相比于硅胶键合固定相，本专利技术采用聚合物微球基质，具有更广泛的pH耐受范围，所用键合蛋白来源广泛、成本低廉，可以规模生产用于蛋白的制备。
附图说明：
[0019]附图1为本专利技术提供的一种实施方式的蛋白质分离专用固定相的制备流程图；
[0020]附图2为本专利技术提供的一种应用实施方式的卵清蛋白、β
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乳球蛋白和α
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乳白蛋白在蛋白质分离专用固定相上的分离谱图。
[0021]附图3为本专利技术提供的一种应用对比方式的卵清蛋白、β
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乳球蛋白和α
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乳白蛋白在甲基丙烯酸缩水甘油酯
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二乙烯基苯共聚物(GMA
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DVB)微球上的分离谱图。
[0022]附图4为本专利技术提供的一种应用实施方式的在蛋白质分离专用固定相上从新鲜牛乳中分离β
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乳球蛋白和α
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乳白蛋白的液相色谱谱图。
具体实施方式：
[0023]以下提供本专利技术一种蛋白分离专用固定相的制备方法：
[0024]实施例1:
[0025]按照图1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白分离分离专用固定相的制备方法，其特征在于，其具体制备步骤为：(1)将0.1～10g聚合物微球分散于10～50mL(优选范围为20～40mL)的磷酸二氢钾
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磷酸氢二钾缓冲溶液(0.1～0.5mol/L(优选范围为0.1～0.3mol/L)，pH 7.0～8.0)中，于20～40℃下震荡10～20min后静置0.5～4h(优选范围为1～2h)，过滤后固体产物中加入10～50mL(优选范围为20～40mL)磷酸二氢钾
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磷酸氢二钾缓冲溶液(0.01～0.1mol/L(优选范围为0.01～0.05mol/L)，pH 7.0～8.0)；(2)将1～10g(优选范围为2～7g)蛋清溶解于10～50mL(优选范围为20～40mL)质量浓度为0.5～1.5％(优选范围为0.7～1.0％)的氯化钠溶液中，过滤除去固体残渣，得蛋清溶液；待步骤(1)中聚合物微球与缓冲溶液平衡0.5～2h(优选范围为0.5～1h)后，将配制好的蛋清溶液加入其中，在20～30℃(优选范围为25～30℃)，以100～200r/min速率震荡12～24h；(3)用质量浓度为0.5～1.5％氯化钠水溶液清洗掉聚合物微球上未反应蛋白后，依次分别用水和甲醇洗涤1～5次后，产物于50～60℃干燥12～24h，得到蛋白分离专用固定相。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的聚合物微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯
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二乙烯基苯共聚物(GMA
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DVB)微球。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，GMA
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DVB聚合物微球的制备：于三口烧瓶中加入1.0～2.0g的聚苯乙烯乳液和20～30mL质量浓度0.1～0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液，同时于一烧杯中加入20～50mL的质量浓度0.1～0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，许森，
申请(专利权)人：苏州瑞恒嘉航医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：