本发明专利技术提供一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法。本发明专利技术的免疫层析试纸条的测试线上固定绿色荧光微球和抗体1，结合垫喷涂抗体2修饰的红色荧光微球；检测病原菌的主要原理为：待测病原菌特征基因经核酸扩增后产生的特异产物激活CRISPR/Cas12a的侧切活性，导致抗原1和抗原2标记的ssDNA断裂，使其流经试纸条测试线时无法固定红色荧光微球，测试线呈绿色；无目标病原菌的样品因无法激活CRISPR/Cas12a，不能切割ssDNA，红色荧光微球偶联ssDNA，并通过抗体1识别ssDNA上的抗原1而被固定在测试线上，使测试线呈红色；根据测试线颜色过渡变化，可肉眼判别目标病原菌的含量，实现半定量检测。实现半定量检测。实现半定量检测。
【技术实现步骤摘要】
一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法
[0001]本专利技术属于食品安全与品质检测领域，具体涉及一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法。
技术介绍
[0002]食源性疾病是世界范围内的一个重要公共卫生问题。大约91％的食源性疾病是由细菌污染引起的。沙门氏菌属、弯曲杆菌属、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌是导致食品相关疫情数量最多的主要病原体。世界各地国家及组织也已经将食品安全防控的焦点从调查食源性疾病暴发后的原因逐渐转移至主动检测和预防食品污染。食品安全检测方法需要更加快速、简便和准确。
[0003]核酸检测在临床诊断、基因编辑、大流行疾病预防以及各种生物医学研究中至关重要。聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)是最早的，也是目前最流行的扩增和检测低丰度核酸的扩增技术。虽然PCR已广泛应用于各个领域，但它需要精密且昂贵的热循环仪，这在很大程度上限制了PCR在资源有限的环境和即时检测(POC)分析中的应用。为了满足在条件受限的环境下信号放大的需求，已经开发了多种等温核酸扩增方法，如重组酶聚合酶扩增 (RPA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、以及链置换扩增(SDA)等。这些等温扩增方法因操作简单、具有较快扩增速度、高灵敏度和选择性、并且能在低温和恒定温度下操作而引起广泛关注。但是，在扩增过程中，二聚体与非靶扩增子的形成等非特异性现象会造成假阳性结果，因而寻找一种高特异性识别靶序列的分析方法是非常有必要的。
[0004]基于聚类规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats，CRISPR)相关核酸酶(Cas)检测是一种很有前景的核酸检测新方法。已有很多工作报道，Cas效应蛋白被用作高度特异性的序列识别元件，与等温扩增技术相联用，结合不同的信号读取方式进行现场检测，极大提高了核酸检测的特异性和准确度。目前，基于 CRISPR/Cas12a结合等温扩增较为常见的信号输出的方式有：(1)被靶标激活的Cas12a无差别切割荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA在紫外激发下产生荧光信号；(2)利用Cas12a 切割ssDNA，结合AuNPs的局部表面等离子共振现象实现颜色变化；(3)切割电化学活性物标记的DNA探针实现电化学信号输出；(4)结合侧流层析试纸条上测试线和质控线显色变化实现肉眼可视读取。其中，侧流层析试纸条具有易于携带、性价比高、使用方便、反应速度快等优点，在现场检测领域得到了广泛的应用。但是，目前已报道的用于与CRISPR/Cas 结合使用的侧流层析试纸条研究中，测试线信号大多是通过anti
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FITC标记的信号探针(AuNPs、QBs等)捕获FITC
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ssDNA
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Biotin得以呈现，测试线信号呈“Turn off”模式—与竞争法侧流层析试纸条分析结果类似。但是“Turn off”比“Turn on”信号输出模式灵敏度低，并且不利于对结果进行判读和理解。为了解决这一问题，许多工作将质控线(C线)、测试线位置对调，使得测试线信号呈“Turn on”模式，但是存在的问题是：1)需确保没有靶标出现时，结合垫上的探针刚好完全被质控线(原测试线)捕获，靶标出现时ssDNA被剪断，释放探针被测试线(原质控线)捕获，从而才能呈现Turn on”模式，这无疑增大试纸条研发期间的工作
量。2)质控线和测试线位置的调换易给非专业人员带来逻辑上的理解障碍，易造成结果的误判。此外，胶体金作为侧流层析试纸条常用的一种信号探针，存在灵敏度低和难以定量的问题，这也是在实际应用急需解决的一大问题。
[0005]一般地，通过肉眼判读胶体金试纸条测试线颜色的强弱时，只能得出“是”或“否”的定性结果，难以实现裸眼半定量或定量。人的肉眼有三种不同类型的锥细胞，它们对不同波长的光的反应模式不同。色相由这三种锥细胞的单个信号计算和积分，因此比亮度更容易识别，所以色相是肉眼读数的最佳选择。此外，色相随三基色(红
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绿
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蓝(R
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G
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B))的强度变化而变化，因此可以利用不同颜色(如R/G)的信号强度比来定量目标浓度。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供了一种基于色相变化检测食源性致病菌的免疫层析试纸条及方法，具体包括以下几个步骤：
[0007](1)免疫层析试纸条的组装；
[0008](2)提取待测样品的基因组DNA；
[0009](3)对待测样本进行恒温扩增；
[0010](4)利用CRISPR/Cas12a对核酸扩增产物进行切割；
[0011](5)采用免疫层析试纸条进行检测；
[0012](6)对免疫层析试纸条检测结果进行定性及半定量判读。
[0013]所述步骤(1)中用于检测食源性致病菌核酸的免疫层析试纸条，其长为6～8cm，宽为3 ～4mm，其结构包括PS底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫(图1、图2)。
[0014]所述PS底板作为侧向流动试纸条的骨架，用于粘贴并固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
[0015]所述样品垫1为玻璃纤维膜构成，固定在试纸条的起始端，作为试纸条与样品直接交流的窗口，用于样品的滴加。
[0016]所述结合垫2固定在样品垫1和硝酸纤维素膜6之间，结合垫2两侧分别与样品垫1和硝酸纤维素膜6有2
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3mm的重叠。所述结合垫表面喷涂了抗体2标记的红色荧光微球。
[0017]所述硝酸纤维素膜6是检测结果的呈现窗口，划了质控线(C线)和测试线(T线)。所述质控线靠近吸水垫一端，固定了抗体1对应的二抗；所述测试线靠近结合垫一端，固定了抗体1和绿色荧光微球。所述质控线和测试线的距离为4～6mm。
[0018]在硝酸纤维素膜(6)上设置测试线(3)和质控线(4)的方法为：取绿色荧光微球gSQS 离心并重悬在含1％w/v Tween
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20的PBS缓冲溶液中，加入抗体1溶液并超声混匀，得到gSQS
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抗体1混合溶液，即为测试线溶液；将测试线溶液和质控线溶液(即抗体2对应的二抗溶液，浓度为1mg/mL,10mM Ph 7.4PBS)分别以1μL/cm的速度，用三维平面点膜喷金仪在硝酸纤维素膜上划线，烘干后即得测试线和质控线。
[0019]所述吸水垫5为待测液流动提供动力，在试纸条的最末端。
[0020]所述抗体1为链霉亲和素、抗地高辛抗体等其他通用抗体中的一种，所述抗体2为链霉亲和素、抗地高辛抗体等抗体中的一种，且抗体1和抗体2为不同种类的抗体。所述抗原1 和抗原2分别对应抗体1和抗体2，抗原1和抗原2为生物素、地高辛等其他通用抗原标签中的一种。所述绿色荧光微球优选但不限于dSiO2@gQDs@SiO2(gSQS)，所述红色荧光微球优选
但不限于dSiO2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于色相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，包括PS底板(7)、样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(6)和吸水垫(5)，在PS底板(7)表面的起始端至末端依次粘贴有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(6)和吸水垫(5)，结合垫(2)两侧分别与样品垫(1)和硝酸纤维素膜(6)重叠，对于两个重叠部分，结合垫(2)位于样品垫(1)下方，硝酸纤维素膜(6)位于结合垫(2)下方；硝酸纤维素膜(6)与吸水垫(5)部分重叠，对于重叠部分，硝酸纤维素膜(6)位于吸水垫(5)下方；所述样品垫(1)为玻璃纤维膜，待测样品滴加于样品垫(1)上；所述结合垫(2)表面喷涂有抗体2标记的红色荧光微球；所述硝酸纤维素膜(6)作为结果的呈现窗口，设置有测试线(3)和质控线(4)，测试线(3)和质控线(4)之间的距离为4～6mm；测试线(3)靠近结合垫，固定有抗体1和绿色荧光微球；质控线靠近吸水垫，质控线(4)上固定有抗体1对应的二抗。2.根据权利要求1所述的一种基于色相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，所述抗体1为链霉亲和素、抗地高辛抗体中的一种，所述抗体2为链霉亲和素、抗地高辛抗体中的另一种，抗体1和抗体2为不同种类的抗体。3.根据权利要求1所述的一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法，其特征在于，所述绿色荧光微球为dSiO2@gQDs@SiO2，是以dSiO2为模板，gQDs自组装和包封的复合纳米材料；所述红色荧光微球为dSiO2@AuNPs@SiO2@rQDs，是以dSiO2为模板、AuNPs和rQDs逐层自组装和包封的复合纳米材料。4.根据权利要求1所述的一种基于色相变化的免疫层析试纸条，其特征在于，在硝酸纤维素膜(6)上设置测试线(3)和质控线(4)的方法为：取绿色荧光微球gSQS离心并重悬在含1％w/v Tween
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20的PBS缓冲溶液中，加入抗体1溶液并超声混匀，得到gSQS
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抗体1混合溶液，即为测试线溶液；将测试线溶液和质控线溶液分别以1μL/cm的速度，用三维平面点膜喷金仪在硝酸纤维素膜上划线，烘干后即得测试线和质控线。5.采用权利要求1～4任一所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)提取待测样品的基因组DNA；步骤2)对待测样本进行恒温扩增；步骤3)利用CRISPR/Cas12a对核酸扩增产物进行识别与切割；步骤4)采用免疫层析试纸条对步骤3)的反应产物进行检测；步骤5)对免疫层析试纸条检测结果进行定性及半定量判读。6.根据权利要求5所述的免疫层析试纸条检测食源性致病菌的方法，其特征在于，所述步骤3)中，利用CRISPR/Cas12a对核酸扩增产物进行切割的反应条件为：Cas12a、crRNA、抗原1和抗原2同时标记的单链DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：王柳，徐霞红，何开雨，王洪梅，袁晶蕊，权浩然，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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