一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法技术

本发明专利技术提供了一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法，所述方法包括专性菌诱导激活土著菌研究，土著菌反向激励专性菌研究两个研究方法。设计对照试验，采用气相色谱质谱联用(GC

【技术实现步骤摘要】
一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法


[0001]本专利技术属于含油污泥微生物
，特别涉及一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法。

技术介绍

[0002]钻采废水处理后产生大量的剩余污泥，其中危害环境的主要成分是石油烃、化学处理剂和重金属。目前，对含油污泥的处理处置方法主要包括焚烧法、固化/稳定化、氧化法以及生物法等，其中生物法因节约能源、运行费用低、作用持久等特点，具有广阔的应用前景。
[0003]长期以来，行业内将高活性、持久性和兼容性专性微生物的选育作为研究重点，并已发现了200多种可降解石油烃的微生物(细菌、真菌和藻类)，其代谢机理主要是微生物利用体内各种酶与石油烃及其中间产物发生脱氢、羟化和过氧化作用，这其中既包括好氧降解也包括厌氧降解。随着筛选的专性微生物不断实现工业化生产，专性微生物菌剂也逐渐成为了油气田现场污泥处理的主力军。然而，国内外油田现场应用效果表明，虽然专性微生物对污泥中石油类特征污染物的降解展现出良好的效果，但需频繁补充维持其在污泥中的丰度以保证处理效果，对于现场操作具有很大挑战。
[0004]实际上，在污泥无害化处置过程中，研究发现专性微生物与其他土著微生物在基质中共存时，专性微生物可最大程度地降低特征污染物的生物毒性，对特征污染物的代谢也为其他微生物的繁衍营造了良好条件，而其他功能微生物的大量繁殖补充了石油污泥中的剩余生态位，如氮磷营养元素的固定。多元微生物体系可缓解石油污泥的恶劣生境条件，进而激励微生物的多元化繁衍。显然，这有利于石油污泥中污染物的稳定降解与剩余污泥的原位利用，但目前尚无针对专性菌与土著菌协同作用原理的研究方法。例如，专利CN113862198A中，公开了一种用于降解含油污泥中油类污染物的复合微生物菌剂及其制备方法和应用，该复合微生物菌剂由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌剂、双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌剂、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌剂和盐脱氮枝芽胞杆菌(Virgibacillus halodenitrificans)菌剂混合而成，仍然是对专性菌的研究，并未涉及到与土著菌的协同。专利CN110746062A公开了一种含油污泥微生物降解及资源化利用方法，采用复配微生物菌剂、复配土壤改良剂、水混合调节含油污泥微生物生态系统，其使用的菌剂同样是专性菌。专利CN112239731A和专利CN113151052A中，则仅仅利用土著菌促进石油烃类的降解。然而，专性菌与土著菌的协同作用原理仍难以探究。

技术实现思路

[0005]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0007]一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法，包括以下步骤：
[0008]步骤(1)，取含油污泥，通过气相色谱质谱联用测定含油污泥初始组分分布，利用实时荧光PCR技术及高通量测序确定含油污泥初始微生物群落结构绝对丰度；
[0009]步骤(2)，将所述含油污泥平均分为a、b、c三份，a油泥接种典型已知石油烃降解菌，模拟专性菌与土著菌协同作用体系；
[0010]b油泥灭菌后接种等量的所述典型已知石油烃降解菌，模拟专性菌单独作用体系；
[0011]c油泥做空白对照，c油泥和接种后的a油泥、b油泥于25
±
2℃恒温摇床降解30d；
[0012]步骤(3)，降解中期分别取样测定三组含油污泥组分分布及微生物群落结构绝对丰度；通过a油泥中石油烃组分碳原子数的变化确定专性菌降解高碳原子数石油烃效果；通过a油泥与c油泥微生物群落结构绝对丰度对比确定土著菌繁殖的增强效果；两者结合评价专性菌降解高碳原子数石油烃改善土著菌生存环境从而促进土著菌增殖的效果；
[0013]步骤(4)，降解结束后，再次分别取样测定三组含油污泥组分分布及微生物群落结构绝对丰度；利用菌株靶向分离方法从b油泥中分离出接种的石油烃降解菌，进行高通量测序；通过a油泥中石油烃组分相较降解中期碳原子数的变化确定土著菌对专性菌代谢产物的降解效果；通过菌株靶向分离出的菌株的高通量测序结果与含油污泥初始高通量测序结果以及石油烃降解菌原本高通量测序结果对比，评价土著菌环境抗性基因水平转移效果；通过a油泥与b油泥微生物群落结构绝对丰度对比，确定土著菌对专性菌的反向激励增殖效果。
[0014]在一个实施例中，所述含油污泥组分分布主要指石油烃碳原子数分布情况。
[0015]在一个实施例中，所述微生物群落结构绝对丰度测定方法如下：
①
提取污泥样品中的DNA，获取DNA样品；
②
通过实时荧光定量PCR方法测定DNA样品中的分类基因总浓度；
③
通过第二代高通量测序方法对DNA样品进行分类基因扩增子高通量测序，获得环境样品中微生物不同分类单元的分类基因相对丰度，所述微生物不同分类单元为界、门、纲、目、科、属、种；
④
将步骤
②
的DNA样品中的分类基因总浓度与步骤
③
的微生物不同分类单元的分类基因相对丰度分别相乘，计算得到微生物不同分类单元的分类基因绝对丰度，从而获得环境中微生物群落结构绝对丰度。
[0016]在一个实施例中，所述步骤(4)，菌株靶向分离方法如下：通过二代(Illumina)、三代高通量测序(PacBio)技术检测样本中微生物的种类及其相对丰度，确定样本中是否有目标微生物，在确定目标微生物的相对丰度后，通过厌氧或需氧培养系统，利用不同配方的培养基进行培养、分离、纯化操作，找到目标菌株，对纯化好的目标菌株进行高通量测序鉴定，从基因水平上确定目标菌株。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的研究方法能够确定专性菌降解高碳原子数石油烃改善土著菌生存环境从而促进土著菌增殖，土著菌降解专性菌代谢产物并通过水平基因转移反向激励专性菌增殖的效果。从而评价专性菌与土著菌的协同作用，为含油污泥生物修复提供新思路。
具体实施方式
[0018]下面结合实施例详细说明本专利技术的实施方式。
[0019]本专利技术是弥补现有研究手段的匮乏，提供了一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法。其中：
[0020]本专利技术专性菌，指典型石油烃降解菌剂，例如铜绿假单胞菌。
[0021]本专利技术土著菌，指原本存在于污染土壤体系中的各种微生物。
[0022]专性菌与土著菌协同包括以下两个方面：
[0023](1)专性菌对诱导激活土著菌增殖：专性菌降解高碳原子数石油烃，改善土著菌生存环境，从而激活土著菌，促进其繁殖。
[0024](2)土著菌反向激励专性菌增殖：土著菌降解专性菌代谢产物，并通过水平基因转移提升专性菌环境抗性，从而激励专性菌增殖。
[0025]本专利技术专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法，包括专性菌诱导激活土著菌研究，土著菌反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)，取含油污泥，通过气相色谱质谱联用测定含油污泥初始组分分布，利用实时荧光PCR技术及高通量测序确定含油污泥初始微生物群落结构绝对丰度；步骤(2)，将所述含油污泥平均分为a、b、c三份，a油泥接种典型已知石油烃降解菌，模拟专性菌与土著菌协同作用体系；b油泥灭菌后接种等量的所述典型已知石油烃降解菌，模拟专性菌单独作用体系；c油泥做空白对照，c油泥和接种后的a油泥、b油泥于25
±
2℃恒温摇床降解30d；步骤(3)，降解中期分别取样测定三组含油污泥组分分布及微生物群落结构绝对丰度；通过a油泥中石油烃组分碳原子数的变化确定专性菌降解高碳原子数石油烃效果；通过a油泥与c油泥微生物群落结构绝对丰度对比确定土著菌繁殖的增强效果；两者结合评价专性菌降解高碳原子数石油烃改善土著菌生存环境从而促进土著菌增殖的效果；步骤(4)，降解结束后，再次分别取样测定三组含油污泥组分分布及微生物群落结构绝对丰度；利用菌株靶向分离方法从b油泥中分离出接种的石油烃降解菌，进行高通量测序；通过a油泥中石油烃组分相较降解中期碳原子数的变化确定土著菌对专性菌代谢产物的降解效果；通过菌株靶向分离出的菌株的高通量测序结果与含油污泥初始高通量测序结果以及石油烃降解菌原本高通量测序结果对比，评价土著菌环境抗性基因水平转移效果；通过a油泥与b油泥微生物群落结构绝对丰度对比，确定土著菌对专性菌的反向激励增殖效果。2.根据权利要求1所述专性菌与土著菌协同降解含油污泥的研究方法，其特征在于，所述含油污泥组分分布主要指石油烃碳原子数分布情况。3.根据权利要求1所述专性菌与土著菌协同降解含油污...

【专利技术属性】
技术研发人员：金鹏康，石烜，白雪，许路，金鑫，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：