一种规模化生产全雌草鱼的方法及应用技术

本发明专利技术属于鱼类的性别控制领域，公开了一种规模化生产全雌草鱼的方法，步骤包括：1）筛选生长快速、健康优良的雌鱼作为后备亲本2）采用异源精子刺激和冷休克处理的雌核发育方法，获得全雌二倍体苗种；3）采集鱼苗DNA，用草鱼性别分子标记Primer

【技术实现步骤摘要】
一种规模化生产全雌草鱼的方法及应用


[0001]本专利技术属于鱼类的性别控制领域，属于一种鱼类遗传繁殖的方法，是以雌核发育技术、人工性逆转、性别分子标记鉴定性别等技术的单性鱼类繁育的
，涉及一种全雌草鱼的生产方法。

技术介绍

[0002]草鱼(Ctenopharyngodon idellus)隶属鲤科(Cyprinidae)，雅罗鱼亚科(Leuciscinae)，草鱼属(Ctenopharyngodon)，食草性鱼类，为我国四大家鱼之一，也是中国产量最大的鱼类，为人民提供了优质的水产蛋白。已有研究表明基于雌核发育获得的全雌草鱼群体具有抗病能力强、生长速度快、成活率高的优势(张国真等，2015；李华等，2015；刘堃等，2015；赵文武等，2016)。因此，大规模培育全雌草鱼群体对于草鱼养殖产业的发展将具有重要推动作用，在提高养殖经济效益的同时，减少养殖过程用药，保护水体生态环境，具有重要的经济、生态和社会效益。
[0003]目前全雌鱼类直接培育技术主要有：人工选择、雌激素诱导直接性逆转、雌核发育等。人工选择法操作繁琐，劳动强度大且无法准确区分鱼苗性别，因此并不适合用于规模化生产全雌草鱼。而雌激素直接诱导法虽然可以使雄性草鱼批量性逆转为雌性草鱼，但此方法获得的商品鱼会有激素残留隐患，且无法保证全雌。目前在生产上主要是使用雌核发育技术生产全雌鱼(Zhang et al.,2011)，但这种技术还存在以下问题：1)培育周期较长，苗种性别辨别困难；2)二倍体出现频率较低；3)苗种幼鱼存活率低，能存活至性成熟数量少。市场上急需一种可大规模繁育全雌草鱼的技术方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于克服上述困难，结合雌核发育和性逆转技术，提供一种更加高效准确、可大规模培育全雌草鱼群体的方法。
[0005]本专利技术的另一个目的在于提供上述方法在草鱼商业化养殖中的应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0007]一种规模化生产全雌草鱼的方法，包括以下步骤：
[0008](1)亲本培育：规模化养殖草鱼，筛选体型优美、生长速度快的雌鱼良种作为后备亲本；
[0009](2)雌核发育：
[0010]①
兴国红鲤精液1
‑
3ml加入2
‑
4倍1
×
Hanks
’
液混匀稀释，平铺于培养皿中，精液厚度0.1
‑
0.2mm，在强度为30w，照距为12cm的紫外线下照射45min，盛精皿被置于冰浴中并在照射过程中用摇床缓慢摇动以使精子能受到均匀照射，每隔15min镜检观察确定灭活情况，直至约20％精子灭活，放入4℃备用。同时取雌鱼亲本的卵子，与灭活的精子混合刺激卵子；
[0011]②
在步骤
①
精卵相遇1min后，将卵子置于4
‑
6℃下冷休克处理25min，诱导获得全雌二倍体草鱼苗种；
[0012]③
待苗种长至2
‑
3cm，随机抽样≥50尾鱼苗剪取少量尾鳍提取全基因组DNA，利用草鱼性别分子标记Primer
‑
184(正向引物：AGCAGCAGGTAGCGGAAGAG，反向引物： AATAACGACAGTTGACAGGATTGAATG)进行性别检测，雌性无条带，雄性有条带；若检测结果为全雌则雌核发育成功，将雌核发育成功苗种继续培养至性成熟作为后续规模化生产亲本；
[0013](3)性逆转
[0014]待上述雌核发育的全雌二倍体草鱼苗种开口后正常培育20
‑
25天，采用雄性激素17α
‑
甲基睾丸酮以浓度60
‑
150mg/kg配合饲料拌料投喂，饲养60
‑
90天，最后转为正常饲料饲养；雄激素处理后存活的鱼苗中60％
‑
80％个体会性逆转为雄性草鱼，还有一部分仍为雌性，待饲养至可按胸鳍形状区分雌雄时，挑选生理雄鱼作为后备父本，并进行强化培育；
[0015](4)规模化生产
[0016]①
人工繁殖前的春季，将正常培育的草鱼雌性亲本，以及雌核发育性逆转为雄鱼的亲本放养在催产池中进行流水刺激，注水频率达每3
‑
5天一次，并定期每次以原池水总量25
‑
30％换水；
[0017]②
水温到达21
‑
23℃时，催产的雌雄鱼按照1:1
‑
1:2的比例，采用背部肌肉注射；两针注射法所用的催产剂为LHRH
‑
A2和DOM，第一针在早上8
‑
9时进行，在水温为21
‑
23℃对雌鱼每千克注射1
‑
1.2μgLHRH
‑
A2，并对雄鱼按0.4
‑
0.5μg注射，完毕后放入产卵池中控制微流水；而 10
‑
12小时后的第二针在当日下午7
‑
9时进行，维持水温下对雌鱼每kg注射5
‑
6μg HRH
‑
A2和 5
‑
6mgDOM，并对雄性注射2.5
‑
3.0μgLHRH
‑
A2和2.5
‑
3.0mgDOM；将注射催产后的草鱼亲本放入产卵池中，人工控制产生水流；
[0018]③
水温达到24
‑
26℃时草鱼自行产卵并受精，将受精卵转入孵化环道中人工孵化出苗，即可获得全雌草鱼。
[0019]本专利技术的保护范围还包括：上述方法在草鱼商业化养殖中的应用。
[0020]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0021]本专利技术提供了全雌草鱼的持续规模化生产过程以及它们的繁殖体系。该繁殖体系的建立时间短，仅需3
‑
4年，即第一年获得雌核发育草鱼群体，采用17α
‑
甲基睾丸酮雄激素混合配合饲料投喂，第3年(广州、海南等等南方地区)或第4年(湖北、四川等中西部地区)时，雌核发育转雄鱼就可发育成熟，产生成熟的精子，与正常的草鱼雌鱼繁殖，即可大规模获得全雌草鱼苗种。此技术体系保障了全雌发育群体的规模化、可持续化生产。体系建立后，全雌草鱼的亩产量比对照普通草鱼提高了15％以上，成活率提高10％以上，大幅度提高了草鱼养殖的综合效益。
附图说明
[0022]图1为本专利技术提供方法的流程图。
[0023]图2为草鱼雄性特异性分子标记鉴定示意图。
具体实施方式
[0024]下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述实施。本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说
明，均来源于商业渠道。
[0025]实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种规模化生产全雌草鱼的方法，包括以下步骤：（1）亲本培育：规模化养殖草鱼，筛选体型优美、生长速度快的雌鱼良种作为后备亲本；（2）雌核发育：兴国红鲤精液1
‑
3 ml加入2
‑
4倍1
×ꢀ
Hanks
’
液混匀稀释，平铺于培养皿中，精液厚度0.1
‑
0.2 mm，在强度为30w，照距为12 cm的紫外线下照射45 min，盛精皿被置于冰浴中并在照射过程中用摇床缓慢摇动以使精子能受到均匀照射，每隔15 min镜检观察确定灭活情况，直至约20%精子灭活，放入4℃备用；同时取雌鱼亲本的卵子，与灭活的精子混合刺激卵子；在步骤精卵相遇1min后，将卵子置于4
‑
6℃下冷休克处理25min，诱导获得全雌二倍体草鱼苗种；待苗种长至2
‑
3 cm，随机抽样≥50尾鱼苗剪取少量尾鳍提取全基因组DNA，利用草鱼性别分子标记Primer
‑
184（正向引物：AGCAGCAGGTAGCGGAAGAG，反向引物：AATAACGACAGTTGACAGGATTGAATG）进行性别检测，雌性无条带，雄性有条带；若检测结果为全雌则雌核发育成功，将雌核发育成功苗种继续培养至性成熟作为后续规模化生产亲本；（3）性逆转待上述雌核发育的全雌二倍体草鱼苗种开口后正常培育20
‑
25天，采用雄性激素17α
‑
甲基睾丸酮以浓度60
‑
150 mg/kg配合饲料拌料投喂，饲养60
‑
90天，最后转为正常饲料饲养；雄激素处理后存活的鱼苗中60%
‑
80%个体会性逆转为雄性草鱼，还...

【专利技术属性】
技术研发人员：高泽霞，黄纬杰，王卫民，卢薛，姜冬火，钱雪桥，
申请(专利权)人：湖北海大种业科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：